早期胃癌組織CD44v6蛋白表達(dá)、LVD變化及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

盛圓，張開(kāi)光，吳海波，杜軍，陳樂(lè)樂(lè)

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥230001)

目前傳統(tǒng)腸型胃癌的疾病模式已被普遍接受[1]。近年提出的腫瘤干細(xì)胞理論為腫瘤起源的認(rèn)識(shí)開(kāi)拓了新視野。CD44是一種惡性腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物，屬于黏附分子家族，作為一種細(xì)胞膜表面糖蛋白介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等，具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等作用。CD44v6是CD44的主要變體之一。有研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6與胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2～4]，可在部分惡性腫瘤癌前病變期或腫瘤早期即表達(dá)升高[5，6]。但目前關(guān)于早期胃癌組織CD44v6蛋白表達(dá)變化的研究較少。淋巴管密度(LVD)是指單位面積的淋巴管數(shù)量。LVD升高與淋巴管生成有關(guān)，而淋巴管生成與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，也是胃癌轉(zhuǎn)移的早期事件之一。故LVD升高可能對(duì)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究觀察了早期胃癌組織CD44v6蛋白表達(dá)及LVD變化，現(xiàn)對(duì)二者的關(guān)系及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行分析，旨在探討二者在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年1月～2012年12月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院收治的早期胃癌患者111例(胃癌組)，均經(jīng)組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首診，均行外科根治術(shù)或內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；②術(shù)后組織病理檢查證實(shí)腫瘤局限于黏膜層或黏膜下層；③臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位原發(fā)癌；②復(fù)發(fā)性胃癌或殘胃癌；③術(shù)前已行放化療等抗腫瘤治療。其中，男75例、女36例；年齡(60.8±10.1)歲；腫瘤最大徑(2.21±1.37)cm；腫瘤部位：賁門(mén)或胃底部33例、胃體部31例、胃竇部47例；浸潤(rùn)深度：黏膜層48例，黏膜下層63例；組織分化程度：高中分化54例，低未分化57例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例；有淋巴管浸潤(rùn)22例，無(wú)淋巴管浸潤(rùn)89例。同期選擇安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院收治的胃黏膜上皮內(nèi)瘤變患者125例，均經(jīng)胃鏡活檢或術(shù)后組織病理檢查明確診斷，其中低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(LGIN)65例(LGIN組)、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(HGIN)60例(HGIN組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往未行胃部手術(shù)或內(nèi)鏡下治療；②經(jīng)胃鏡活檢或術(shù)后組織病理檢查證實(shí)，存在上皮結(jié)構(gòu)紊亂或細(xì)胞異型，包括異型增生和原位癌。LGIN組男45例、女20例，年齡(59.6±11.3)歲；HGIN組男41例、女19例，年齡(60.5±9.2)歲。同期選擇在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院健康查體、經(jīng)胃鏡活檢證實(shí)存在慢性淺表性胃炎者50例(胃炎組)，排除有消化系統(tǒng)不適癥狀者、既往有胃部手術(shù)史者及合并萎縮性胃炎、腸上皮化生或上皮內(nèi)瘤變者。其中，男36例、女14例，年齡(59.3±10.5)歲。各組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 胃組織CD44v6蛋白表達(dá)及LVD檢測(cè) 采用免疫組化二步法。胃癌組、HGIN組標(biāo)本來(lái)源于外科根治術(shù)或內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)，胃炎組、LGIN組標(biāo)本來(lái)源于胃鏡活檢。所有組織標(biāo)本用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。65 ℃烤片過(guò)夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，檸檬酸緩沖液煮沸抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫；PBS沖洗5 min×3次，3% H2O2室溫孵育8 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS沖洗5 min×3次，分別滴加CD44v6單克隆抗體(1∶250)、鼠抗人D2-40單克隆抗體(1∶25)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；PBS沖洗5 min×3次，滴加快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育15～20 min；PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片判斷結(jié)果：①CD44v6蛋白表達(dá)：CD44v6蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞膜上，在細(xì)胞膜周?chē)蔬B續(xù)的棕黃(褐)色線狀或帶狀分布。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，觀察染色強(qiáng)度，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例綜合判定結(jié)果。染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例：≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。二者乘積≥3分為CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)。②LVD：染成深黃色的管腔判定為淋巴管，以單位面積上D2-40標(biāo)記的淋巴管數(shù)量作為L(zhǎng)VD。先在低倍鏡(×40)視野下確定淋巴管數(shù)量最多的熱點(diǎn)區(qū)域，然后在高倍鏡(×200)視野下每張切片選取5個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，計(jì)數(shù)每個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域的淋巴管數(shù)量，取其平均值。D2-40染色的淋巴管腔內(nèi)出現(xiàn)癌細(xì)胞或癌細(xì)胞團(tuán)判定為淋巴管浸潤(rùn)。

1.3 早期胃癌組織CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)、LVD的關(guān)系及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 收集早期胃癌患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤部位、浸潤(rùn)深度、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)等，分析CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)、LVD與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法分析二者的相關(guān)性。

1.4 LVD預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能分析 采用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估LVD預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能。

2 結(jié)果

2.1 各組CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)及LVD比較 見(jiàn)表1。

表1 各組CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)及LVD比較

注：與胃炎組比較，*P<0.05；與LIGN組比較，#P<0.05；與HIGN組比較，△P<0.05。

2.2 早期胃癌組織CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)、LVD與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 早期胃癌組織CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)、LVD均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡和腫瘤部位、最大徑、組織分化程度及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)、LVD與早期胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 早期胃癌組織CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)與LVD的關(guān)系 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，早期胃癌組織CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)與LVD呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.302，P<0.01)。

2.4 LVD預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能分析 ROC曲線分析顯示，LVD預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.835(95%CI：0.758～0.912)，其cut off值為14個(gè)，此時(shí)其預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性為63.4%、特異性為90.0%。

3 討論

Correa等[1]提出，腸型胃癌疾病模式是由正常胃黏膜→慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生(包括LGIN和HGIN)→早期胃癌→進(jìn)展期胃癌。目前這種疾病模式已被普遍接受。近年提出的腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，惡性腫瘤來(lái)源于極少數(shù)具有自我更新、無(wú)限增殖能力的腫瘤干細(xì)胞。胃癌干細(xì)胞有兩種起源學(xué)說(shuō)，即胃干細(xì)胞和骨髓源性干細(xì)胞。研究表明，胃干細(xì)胞或骨髓源性干細(xì)胞在基因突變、炎癥、損傷等作用下，最終導(dǎo)致胃黏膜異型增生或腸型胃癌的發(fā)生[7，8]。此外，腫瘤干細(xì)胞還與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是腫瘤復(fù)發(fā)和放化療抵抗的主要原因[9，10]。

CD44是一種重要的胃癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物[11]，屬于黏附分子家族，作為一種細(xì)胞膜表面糖蛋白介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與透明質(zhì)酸的親和力，改變細(xì)胞與基質(zhì)的黏附作用，參與腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移。CD44v6是CD44的重要變異體之一，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。目前普遍認(rèn)為，CD44v6高表達(dá)與進(jìn)展期胃癌分期、轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良有關(guān)[3，4]。在部分腫瘤癌前病變期或腫瘤早期CD44v6即可出現(xiàn)表達(dá)升高，故有學(xué)者將CD44v6作為診斷部分組織癌前病變和早期腫瘤的分子標(biāo)志物，如肺癌前病變[5]、早期胰腺癌[6]。但其在胃癌前病變或早期胃癌組織中表達(dá)的研究較少。da Cunha等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6蛋白僅在正常胃黏膜的胃竇部腺管中微弱表達(dá)，在增生性息肉和完全腸上皮化生組織中表達(dá)輕度增加，不完全腸上皮化生和上皮內(nèi)瘤變組織中表達(dá)明顯增加。Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6蛋白在正常組織中不表達(dá)，上皮內(nèi)瘤變與早期胃癌組織中即出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，在進(jìn)展期胃癌組織表達(dá)水平顯著增加。本研究結(jié)果顯示，胃炎組、LGIN組與HGIN組或胃癌組CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)逐漸升高，與上述研究結(jié)果基本一致。說(shuō)明CD44v6在胃黏膜早期惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這將有助于癌前病變及早期胃癌的診斷。胃癌組與HGIN組CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與HGIN相當(dāng)于重度異型增生或原位癌，組織形態(tài)學(xué)上已接近癌組織，故二者在CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)上比較接近。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)與早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)有關(guān)，表明CD44v6可能參與早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。故早期檢測(cè)CD44v6可能對(duì)預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定參考價(jià)值。

LVD是指單位面積的淋巴管數(shù)量。早期研究認(rèn)為，腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤侵犯周?chē)馨凸苡嘘P(guān)，目前認(rèn)為腫瘤可誘導(dǎo)新生淋巴管生成。LVD增加與淋巴管生成有關(guān)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管生成和淋巴管浸潤(rùn)向局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，故LVD、淋巴管浸潤(rùn)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。一些學(xué)者認(rèn)為，LVD可作為預(yù)測(cè)肺癌、結(jié)腸癌等淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的指標(biāo)[14，15]。Gao等[16]研究認(rèn)為，LVD可作為胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。王曉蕾等[17]研究認(rèn)為，LVD與胃癌淋巴管浸潤(rùn)、腫瘤大小和浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、靜脈浸潤(rùn)等有關(guān)，LVD和淋巴管浸潤(rùn)均具有預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值，而LVD還是預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，胃炎組、LGIN組、HGIN組、胃癌組LVD逐漸增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)有關(guān)。表明LVD增加可能是早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病理特征之一。

Lee等[18]研究認(rèn)為，LVD是早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，可根據(jù)LVD預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。本研究ROC曲線分析顯示，LVD預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.835，其cut off值為14個(gè)，此時(shí)其預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性為63.4%、特異性為90.0%。說(shuō)明LVD預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值較高。本研究還發(fā)現(xiàn)，早期胃癌組織CD44v6蛋白陽(yáng)性表達(dá)和LVD呈正相關(guān)關(guān)系。提示聯(lián)合檢測(cè)CD44v6蛋白表達(dá)、LVD可預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，早期胃癌組織CD44v6蛋白表達(dá)、LVD升高，二者均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。聯(lián)合檢測(cè)CD44v6蛋白表達(dá)、LVD可預(yù)測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

[1] Correa P, Piazuelo MB. The gastric precancerous cascade[J]. J Dig Dis, 2012,13(1):2-9.

[2] Todaro M, Gaggianesi M, Catalano V, et al. CD44v6 is a marker of constitutive and reprogrammed cancer stem cells driving colon cancer metastasis[J]. Cell Stem Cell, 2014,14(3):342-356.

[3] Xie JW, Chen PC, Zheng CH, et al. Evaluation of the prognostic value and functional roles of CD44v6 in gastric cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2015,141(10):1809-1817.

[4] Fang M, Wu J, Lai X, et al. CD44 and CD44v6 are correlated with gastric cancer progression and poor patient prognosis: evidence from 42 studies[J]. Cell Physiol Biochem, 2016,40(3-4):567-578.

[5] Wimmel A, Kogan E, Ramaswamy A, et al. Variant expression of CD44 in preneoplastic lesions of the lung[J]. Cancer, 2001,92(5):1231-1236.

[6] Wang H, Rana S, Giese N, et al. Tspan8, CD44v6 and alpha6beta4 are biomarkers of migrating pancreatic cancer-initiating cells[J]. Int J Cancer, 2013,133(2):416-426.

[7] Li XB，Yang G，Zhu L，et al. Gastric Lgr5 (+) stem cells are the cellular origin of invasive intestinal-type gastric cancer in mice[J]. Cell Res, 2016,26(7):838-849．

[8] Donnelly JM， Engevik AC， Engevik M， et al. Gastritis promotes an activated bone marrow-derived mesenchymal stem cell with a phenotype reminiscent of a cancer-promoting cell[J]. Dig Dis Sci, 2014,59(3):569-582．

[9] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J]. Nature, 2001,414(6859):105-111.

[10] Visvader JE, Lindeman GJ. Cancer stem cells: current status and evolving complexities[J]. Cell Stem Cell, 2012,10(6):717-728.

[11] Takaishi S, Okumura T, Tu S, et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44[J]. Stem Cells, 2009,27(5):1006-1020.

[12] da Cunha CB, Oliveira C, Wen X, et al. De novo expression of CD44 variants in sporadic and hereditary gastric cancer[J]. Lab Invest, 2010,90(11):1604-1614.

[13] Xu YY, Guo M, Yang LQ, et al. Regulation of CD44v6 expression in gastric carcinoma by the IL-6/STAT3 signaling pathway and its clinical significance[J].Oncotarget, 2017,8(28):45848-45861.

[14] Adachi Y, Nakamura H, Kitamura Y, et al. Lymphatic vessel density in pulmonary adenocarcinoma immunohistochemically evaluated with anti-podoplanin or anti-D2-40 antibody is correlated with lymphatic invasion or lymph node metastases[J]. Pathol Int, 2007,57(4):171-177．

[15] Kaneko I, Tanaka S, Oka S，et al．Lymphatic vessel density at the site of deepest penetration as a predictor of lymph node metastasis in submucosal colorectal cancer[J]. Dis Colon Rectum, 2007,50(1):13-21．

[16] Gao P, Zhou GY, Zhang QH, et al. Clinicopathological significance of peritumoral lymphatic vessel density in gastric carcinoma[J]. Cancer Lett, 2008,263(2):223-230.

[17] 王曉蕾，艾自勝，方建萍，等.D2-40標(biāo)記的淋巴管密度和淋巴管浸潤(rùn)對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的影響[J].中華消化雜志，2009，29(8)：562-564.

[18] Lee K, Park DJ, Choe G, et al. Increased intratumoral lymphatic vessel density correlates with lymph node metastasis in early gastric carcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2010,17(1):73-80.