健脾軟肝方對四氯化碳誘導肝纖維化大鼠肝竇基底膜形成的影響

陳文玲，杜良，陳文慧，譚麗萍，姚政，石安華

(1 云南中醫學院，昆明650500；2 本溪市第九人民醫院)

肝纖維化以肝內纖維組織生成和降解失平衡，膠原纖維彌漫性增生、沉積，但不形成假小葉結構為特征，是各種慢性肝病發展至肝硬化必經的病理過程[1]。肝纖維化過程中一個重要的病理改變是纖維間隔近旁肝竇毛細血管化，而肝竇內皮下基底膜形成是肝竇毛細血管化的重要特征[2,3]。因此推測，早期阻止肝竇內皮下基底膜形成有可能逆轉肝纖維化形成，這或許會成為防治肝硬化的新途徑。健脾軟肝方是云南省名老中醫蘇漣教授治療肝病的經驗方，經肝組織穿刺活檢發現，該方治療后可延緩肝纖維化形成[4]。但其作用機制是否與阻止肝竇內皮下基底膜形成有關尚不清楚。2014年5月～2016年3月，本研究觀察了健脾軟肝方對四氯化碳(CCl4)誘導肝纖維化大鼠肝竇內皮下基底膜形成的影響。現分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠60只，清潔級，2月齡，體質量(150±10)g，由成都達碩生物科技有限公司提供。所有大鼠自由攝食、飲水，于云南中醫學院實驗動物房中分籠飼養，環境溫度20～22 ℃，相對濕度50%～55%，通風良好。健脾軟肝方，由云南中醫學院門診部藥房提供生藥；扶正化瘀膠囊，上海黃海制藥有限責任公司；CCl4，天津市光復科技發展有限公司。JEM-1011型透射電鏡，日本電子株式會社；7500fast型PCR擴增儀，美國BIO公司；Step OneTM型熒光定量PCR儀，美國ABI公司；Image-pro Plus5.0圖像分析系統，日本奧林巴斯株式會社。兔抗鼠層黏連蛋白(LN)多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；生物素-HRP免疫組化試劑盒(兔)，包括生物素二抗、ABC復合物，上海生工生物工程股份有限公司。TRIzol試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)，美國BBI公司。

1.2 健脾軟肝方制備 健脾軟肝方方藥組成：蘭花參20 g，三七2 g，莪術15 g，白芍15 g，香附8 g。用水煎煮，去渣濃縮成稠浸膏狀[5]，4 ℃冰箱冷藏。

1.3 肝纖維化模型制作及分組處理 所有大鼠適應性喂養1周，按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、扶正化瘀膠囊組及健脾軟肝方高、中、低劑量組，每組10只。除正常對照組外，其余各組制備肝纖維化模型：腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液2 mL/kg，每周2次，連續注射4周。造模同時，健脾軟肝方高、中、低劑量組根據人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值分別給予健脾軟肝方10.8、5.4、2.7 g/(kg·d)灌胃，扶正化瘀膠囊組給予扶正化瘀膠囊0.4 g/(kg·d)灌胃。正常對照組和模型組給予生理鹽水15 mL/(kg·d)灌胃，連續灌胃4周。

1.4 相關指標觀察 末次灌胃結束，各組禁食12 h、不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速剖腹，取肝組織。選取肝臟質地最硬部分，切成1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm大小的多個組織塊，一部分用10%中性甲醛固定，用于觀察組織病理變化；一部分用3.5%戊二醛固定，用于透射電鏡下觀察肝竇基底膜超微結構；其余部分-80 ℃保存，用于檢測肝組織ColⅣ、LN表達。

1.4.1 肝組織病理變化 采用Mallory染色法。取10%中性甲醛固定的肝組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，3 μm厚切片。將切片置于重鉻酸鉀溶液10 min，蒸餾水沖洗2 min；酸性復紅液染色2 min，蒸餾水稍洗；苯胺藍溶液染色20 min，95%乙醇快速分化；無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.4.2 肝竇基底膜超微結構 取出3.5%戊二醛固定的肝組織，1%鋨酸再固定，乙醇、丙酮逐級脫水；然后用環氧樹脂618滲透、包埋，70 ℃聚合20 h，將組織塊用光鏡定位、修塊，超薄切片機切片，檸檬酸鉛-醋酸雙氧鈾雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.4.3 肝組織ColⅣ、LN mRNA表達 采用Real-time PCR法。取出冰凍的肝組織，復溫后根據TRIzol試劑盒說明提取組織總RNA，按第一鏈cDNA合成試劑盒說明逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：ColⅣ上游引物5′-CAGCAATTAGGCAGGTCAAGT-3′，下游引物5′-TGGTGTTTTCACATTCGGTG-3′；LN上游引物5′-CCATGATGACGGCACTTTTC-3′，下游引物5′-GTCAATCCACAGGTAGACGAG-3′；內參β-actin上游引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′。PCR反應體系共20 μL：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL、Template (cDNA)2 μL；反應條件：95 ℃ 7 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4.4 肝組織LN蛋白表達 采用ABC法。取出冰凍的肝組織，復溫后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，3 μm厚切片。切片常規脫蠟至水，高溫高壓法抗原修復，3%過氧化氫封閉20 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加兔抗鼠LN多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗5 min×3次，滴加生物素標記的二抗室溫孵育2 h；PBS沖洗5 min×3次，滴加ABC復合物室溫孵育2 h；PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明，中性樹膠封固，光鏡下觀察。LN蛋白陽性表達定位于細胞質，呈棕黃色顆粒狀。每張切片隨機選取5個400倍視野，采用Image-pro Plus5.0軟件分析每個視野積分光密度值，以其平均值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組肝組織病理變化 正常對照組肝組織可見肝小葉結構完整，僅在匯管區、中央靜脈周圍有少量膠原纖維沉積。模型組肝組織可見大量呈深藍色的膠原纖維彌漫性增生、沉積，將正常肝小葉分隔包繞。與模型組相比，扶正化瘀膠囊組及健脾軟肝方高、中、低劑量組肝組織中膠原纖維沉積相對減少，面積相對減小，分割包繞程度減輕。

2.2 各組肝竇基底膜超微結構變化 正常對照組肝竇內皮細胞呈扁平狀，遠側胞質有許多不連續的窗孔，內皮下未見基底膜，Disse間隙內有少量的膠原纖維沉積。模型組肝竇內皮下可見到連續或不完整的基底膜，Disse間隙內可見膠原纖維束。扶正化瘀膠囊組及健脾軟肝方高、中、低劑量組肝竇內皮下基底膜不完整，Disse間隙內膠原纖維較少，均較模型組有所改善。

2.3 各組ColⅣ mRNA表達比較 正常對照組ColⅣ mRNA相對表達量為0.910±0.017，模型組為3.041±0.505，扶正化瘀膠囊組為1.472±0.285，健脾軟肝方高劑量組為2.601±0.270，健脾軟肝方中劑量組為1.836±0.234，健脾軟肝方低劑量組為2.349±0.649。與正常對照組比較，模型組ColⅣ mRNA相對表達量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，健脾軟肝方中劑量組和扶正化瘀膠囊組ColⅣ mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05)，健脾軟肝方高、低劑量組雖然ColⅣ mRNA相對表達量均降低，但差異無統計學意義(P均>0.05)。健脾軟肝方高、中、低劑量組間ColⅣ mRNA相對表達量比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.4 各組LN mRNA和蛋白表達比較 見表1。

表1 各組LN mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與扶正化瘀膠囊組比較，△P<0.05；與健脾軟肝方高劑量組比較，▲P<0.05。

3 討論

中醫并無肝纖維化這一名詞，但類似描述最早記載于《靈樞·水脹篇》“腹脹，身皆大，色蒼黃，腹筋起”。目前中醫認為，肝纖維化屬于“鼓脹”“積聚”“朦脹”“廟積”等范疇，治法以清熱解毒、益氣化瘀、軟堅散結等為主[6，7]。中醫藥防治肝纖維化特色鮮明，已有多種方藥用于臨床。如有研究者采用芪葉保肝飲[8]、逍遙散[9]等復方治療肝纖維化。蘇漣等[4]研究認為，肝纖維化是在長期病理狀況下肝的氣機調節障礙、臟腑功能虛損，導致肝郁脾虛，瘀血阻絡，應以健脾益氣、理氣活血、軟肝化積為治則。健脾軟肝方是蘇漣教授治療肝纖維化的有效經驗方[4]，該方由蘭花參、三七、莪術、白芍、香附組成，蘭花參健脾益氣、補虛解表，三七化瘀止血、活血止痛，白芍斂陰養血柔肝，香附疏肝理氣止痛，莪術破血行氣止痛。諸藥合用，相輔相成，行健脾益氣、理氣活血、軟肝化積之功效。前期研究已證實，健脾軟肝方能延緩肝纖維化形成。但對其可能的作用機制尚不清楚。

肝竇毛細血管化是肝纖維化過程中一個重要的病理改變，主要特征是肝竇內皮細胞失窗孔和內皮下基底膜形成[10,11]。因此，阻止基底膜形成可延緩肝纖維化發展。研究證實，基底膜的主要成分包括ColⅣ、LN、entactin、纖維連接蛋白等[12]，其中ColⅣ、LN是肝竇基底膜形成的早期標志物[13,14]。生理狀態下，肝竇內皮下無基底膜。當發生肝纖維化時，LN上的一個結構域可與ColⅣ結合，形成十字形立體結構異常沉積物，繼而參與基底膜形成[15]，影響肝細胞與血液間的物質交換，使肝細胞變性、壞死和肝竇塌陷[16]，膠原纖維增生，長此惡性循環即可導致肝纖維化形成。黃月紅等[17]研究也表明，CCl4誘導的早期肝纖維化大鼠基底膜是由ColⅣ與LN沉積共同構成。

扶正化瘀膠囊是臨床常用治療肝纖維化的中成藥，其臨床療效已得到證實[18]。本研究結果顯示，扶正化瘀膠囊組與健脾軟肝方各劑量組用藥后肝組織膠原纖維沉積均減少，基底膜病變均減輕，肝組織ColⅣ、LN表達均降低，證實健脾軟肝方亦具有抗肝纖維化作用，與前期研究[19]結果一致。為進一步探討健脾軟肝方抗肝纖維化作用與基底膜有關，我們觀察了肝竇基底膜超微結構及肝竇基底膜形成的早期標志物ColⅣ、LN表達變化，結果發現，模型組電鏡下可見連續或不完整的基底膜形成，肝組織ColⅣ、LN mRNA及LN蛋白相對表達量均明顯增加；與模型組比較，扶正化瘀膠囊組與健脾軟肝方各劑量組肝竇內皮下基底膜形成延緩，Disse間隙內膠原纖維較少，肝組織ColⅣ、LN mRNA及LN蛋白表達降低。健脾軟肝方各劑量組ColⅣ mRNA表達降低以中劑量組最為顯著，高、低劑量組比較無明顯統計學差異，其原因可能與樣本較少有關。在下一步的工作中，我們將進一步對健脾軟肝方抗肝纖維化是否通過作用于ColⅣ、LN起效、可能涉及哪些信號通路、如何調控進行深入研究，以期明確其作用機制，豐富健脾軟肝方治療肝纖維化的科學內涵。

綜上所述，健脾軟肝方能延緩CCl4誘導的肝纖維化大鼠基底膜形成，發揮抗肝纖維化作用；其作用機制可能與降低肝組織ColⅣ、LN表達有關。

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