異煙肼致肝細胞損傷過程中組蛋白乙酰化對內質網應激的調控作用

李金鳳，杜瑩，李標，張一楊，李瑩淑，韓鐵生，任琦，馮福民

(華北理工大學公共衛生學院，河北唐山063000)

異煙肼(INH)是WHO推薦的一線抗結核藥物，在抗結核治療中具有不可替代的作用[1，2]，但長期服用可導致藥物性肝損傷。流行病學調查表明，長期服用INH的結核患者轉氨酶升高發生率為10%～20%[3]，其中1%～3%患者可出現嚴重肝損傷，已成為抗結核治療終止的重要原因之一[4]。肝細胞損傷后，打破了細胞內組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙?；傅膭討B平衡，干擾了染色質重塑，造成炎性因子(如IL-6)、氧化應激指標(如活性氧)等基因異常表達[5，6]。當受損的肝細胞持續受到INH刺激時，大量未折疊蛋白在內質網腔內堆積，產生內質網應激(ERS)[7]。有研究表明，組蛋白乙酰化酶P300可特異性結合在葡萄糖調節蛋白78(GRP78)基因啟動子區，調控其下游ERS相關基因表達，繼而參與細胞周期調控[8]；非酒精性脂肪肝中組蛋白去乙?；窰DAC1水平變化可影響CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)的表達，引起慢性ERS，擾亂肝細胞脂質平衡，誘導肝細胞脂肪變性[9，10]。目前在INH致肝細胞損傷過程中組蛋白乙酰化與ERS是否有關尚不清楚。C646為P300的抑制劑，可通過降低P300表達參與細胞的各種生命活動[11]；MS-275可通過抑制HDAC1降低組蛋白乙?；?，與基因轉錄活性有關[12]。因此推測，組蛋白乙酰化可能通過調控ERS參與INH致肝細胞損傷。2017年1～5月，我們在INH致肝細胞損傷模型中分別給予C646或MS-275干預，觀察了組蛋白乙酰化對ERS的調控作用，以期為INH致肝細胞損傷的預防提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常肝細胞株HL-7702(以下稱HL-7702細胞)，購自中國科學院上海分院。INH，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；C646，美國Cayman Chemical公司；MS-275，瑞士J&K Scientific Ltd公司。臺式高速冷凍離心機，德國Heraeus集團；PCR基因擴增儀，美國Bio-Rad公司；酶標儀，美國Molecular Devices公司；熒光定量RCR儀，美國Applied Biosystems公司。二甲基亞砜，日本東京化成工業株式會社；RPMI 1640，美國Corning cellgro公司；ALT、AST檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；TaKaRa反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；TRIzol，北京百泰克生物技術有限公司；ELISA試劑盒，中國北京冬歌偉業科技有限公司。

1.2 細胞培養 將HL-7702細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養液中，制成細胞懸液。取細胞懸液5～7 mL分裝于50 mL細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中，隔天換液1次，待培養瓶底鋪滿單層細胞時，按1∶2比例進行傳代。取傳5代對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 肝細胞損傷模型制備及鑒定 參照本課題組前期研究方法制備肝細胞損傷模型[13]。取傳5代對數生長期細胞，接種于含RPMI 1640培養液的6孔板，每孔2×105個，37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中常規培養。培養24 h，隨機將細胞分為觀察組、對照組，觀察組更換為含INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培養液，對照組更換為新的RPMI 1640培養液，繼續培養3 h，收集細胞培養液，1 000×g離心5 min，留取上清液。采用ELISA法檢測培養液上清ALT、AST活性。根據ALT、AST檢測試劑盒說明繪制標準曲線，并按標準曲線計算ALT、AST活性。結果顯示，觀察組培養液上清ALT活性為(4.31±0.40)IU/L，AST活性為(5.87±0.54)IU/L，對照組分別為(1.44±0.32)、(4.73±0.59)IU/L。觀察組培養液上清ALT、AST活性均明顯高于對照組(P均<0.05)。表明觀察組已經出現肝細胞損傷。

1.4 細胞分組處理 取傳5代對數生長期細胞，接種于含2 mL RPMI 1640培養液的6孔板，每孔2×105個，37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中常規培養。培養24 h，隨機將細胞分為空白對照組、INH組、C646組、INH+C646組、MS-275組和INH+MS-275組，每組設6個復孔。空白對照組更換為2 mL新的RPMI 1640培養液；INH組更換為2 mL含INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培養液；C646組更換為2 mL含C646 5 μmol/L的RPMI 1640培養液；INH+C646組更換為2 mL含C646 5 μmol/L和INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培養液；MS-275組更換為2 mL含MS-275 5 μmol/L的RPMI 1640培養液；INH+MS-275組更換為含MS-275 5 μmol/L和INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培養液。各組繼續培養3 h。

1.5 相關指標觀察

1.5.1 肝細胞P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA表達 采用Real-time PCR法。收集各組處理3 h細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，酶標儀檢測260、280 nm波長處的吸光度(A)值，A260/A280為1.8～2.0，表明提取的總RNA純度合格。取總RNA 2 μL，按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明將其反轉錄為cDNA，反應條件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 1 min。以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。P300上游引物：5′-AGAAGATGAAGCGGGTTGTG-3′，下游引物：5′-CAGTTGGTGTCGTTGGAGTG-3′；HDAC1上游引物：5′-GGCATCTGGCTTCTGTTACG-3′，下游引物：5′-CTCGTCATCAATCCCGTCTC-3′；GRP78上游引物：5′-GCACAGACGGGTCATTCCAC-3′，下游引物：5′-TCCTATGTCGCCTTCACTCC-3′；CHOP上游引物：5′-CAGAACCAGCAGAGGTCACA-3′，下游引物：5′-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3′；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，下游引物：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。PCR反應體系共20 μL：ROX Reference Dye 0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，DEPC水6.8 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL；反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復6次，取平均值。

1.5.2 肝細胞P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量 采用ELISA法。收集各組處理3 h細胞培養液，1 000×g離心5 min，留取培養液上清。根據ELISA試劑盒說明繪制標準曲線，根據標準曲線計算各組P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量。

2 結果

2.1 各組P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA表達比較 見表1。

2.2 各組培養液上清P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量比較 見表2。

表1 各組P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與INH組比較，#P<0.05。

表2 各組培養液上清P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與INH組比較，#P<0.05。

3 討論

結核病是由結核桿菌引起的、嚴重威脅人類健康的慢性疾病。據WHO報道，近年來結核病“死灰復燃”，與艾滋病、瘧疾一起成為三大傳染病。我國是結核病高負擔國家之一，WHO推薦的一線抗結核藥物INH、利福平、吡嗪酰胺等均對肝臟有不同程度毒性作用，聯合用藥時肝損害更嚴重，嚴重時可發生慢性肝炎、肝纖維化甚至肝衰竭等，常常迫使抗結核治療中斷，繼而患者病情加重，同時亦使結核桿菌耐藥風險增加。抗結核藥物性肝損傷由抗結核藥物代謝終產物在體內蓄積引起，破壞了細胞內穩態，導致肝細胞凋亡，繼而產生肝損傷，其嚴重程度因個體差異而不同，目前尚難預測。因此，探討抗結核藥物性肝損傷中的發生機制具有重要意義。

INH在體內主要經肝臟代謝，在肝細胞中經過乙酰轉移酶2和細胞色素P450酶系催化，大部分代謝產物經腎臟排出體外，但小部分代謝產物可在體內殘留、蓄積，并可直接與肝細胞內大分子結構發生共價結合，改變細胞內組蛋白乙酰化水平，進而誘發肝細胞損傷。組蛋白乙?；怯山M蛋白乙?；窹300和組蛋白去乙?；窰DAC1共同調控，可通過調控IL-2等轉錄因子活性，增強細胞內NF-κB等炎性因子表達，繼而參與酒精性脂肪肝、肝纖維化等肝臟疾病的發生、發展[14]。P300可結合到組蛋白N端富含賴氨酸殘基的尾部，促進染色質轉錄激活，啟動組蛋白乙酰化作用，而HDAC1可使染色質結構致密，抑制基因轉錄，使組蛋白去乙?；?，二者可相互拮抗。有研究報道，INH能通過影響P300和HDAC1的動態平衡來改變細胞中組蛋白乙酰化狀態，從而導致大鼠肝細胞損傷[15]。本研究通過INH處理HL-7702細胞制備肝細胞損傷模型，結果顯示，觀察組培養液上清ALT、AST含量明顯高于對照組，證實INH處理可致肝細胞損傷。本研究結果顯示，與空白對照組比較，INH組P300 mRNA表達和蛋白含量均明顯降低，HDAC1 mRNA表達和蛋白含量均明顯增加，證實組蛋白乙?；瘏⑴cINH致肝細胞損傷過程，與本課題組前期研究[15]結果一致。

內質網是真核生物細胞中與分泌相關的重要細胞器，可參與蛋白的合成、轉運、折疊和修飾。當外源性或內源性物質刺激細胞時，大量未折疊和錯誤折疊的蛋白在內質網堆積，影響細胞內鈣穩態，誘發ERS。GRP78表達增加會促進細胞存活，而促凋亡分子CHOP表達增加則會促進細胞凋亡，二者作為ERS的標志性分子，在ERS過程中具有重要作用。既往研究發現，ERS與非酒精性脂肪肝、肝硬化等肝臟疾病的發生、發展密切相關[16～19]。槲皮素可升高CHOP mRNA和蛋白表達，激活ERS信號通路，誘導肝星狀細胞凋亡[20]；糖尿病大鼠經鏈唑霉素處理后，肝組織GRP78蛋白表達明顯升高，未折疊蛋白反應作為ERS的保護性反應，其信號通路被激活，導致肝細胞損傷[21]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，INH組GRP78、CHOP mRNA表達和蛋白含量均明顯升高，說明ERS參與INH致肝細胞損傷過程。但組蛋白乙?；欠駞⑴c調控ERS，繼而導致肝細胞損傷尚不清楚。

研究報道，在大鼠心肌缺血再灌注損傷中，曲古霉素A可上調ERS相關蛋白GRP78啟動子處組蛋白H4乙酰化水平[22]；丙戊酸可通過抑制HDAC活性提高GRP78蛋白表達和整體組蛋白H3的乙?；剑种艭HOP上調，促進內質網分子伴侶表達，減輕ERS誘導的糖尿病腎病細胞凋亡[23]。組蛋白乙酰化可促進CFTR基因表達，誘發ERS，促進高同型半胱氨酸所致損傷肝細胞的凋亡[24]。上述研究表明，組蛋白乙酰化可在一定程度上調控ERS，但其調控ERS參與肝臟疾病的報道鮮見。組蛋白乙?；敢种苿〤646對P300具有高度選擇性，可通過結合到P300的Lys-CoA結構區對其功能產生競爭性抑制；而組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275能顯著抑制HDAC1活性，增加細胞內組蛋白乙?；潭?。為進一步研究INH致肝細胞損傷中組蛋白乙?；瘜RS的調控作用，我們在制備肝細胞損傷模型同時分別加入C646或MS-275干預，結果顯示，與INH組比較，INH+C646組中P300 mRNA表達和蛋白含量均明顯降低，說明其組蛋白乙?；浇档?，而ERS標志性分子GRP78 mRNA表達和蛋白含量均明顯下降，CHOP mRNA表達和蛋白含量均明顯升高，說明肝細胞損傷加重；與INH組比較，INH+MS-275組HDAC1 mRNA表達和蛋白含量均明顯降低，說明組蛋白乙?；缴撸珿RP78 mRNA表達和蛋白含量均明顯升高，CHOP mRNA表達和蛋白含量均明顯降低，說明ERS得到緩解，肝細胞損傷減輕。由此可見，在INH致肝細胞損傷過程中，C646和MS-275均可通過改變細胞內組蛋白乙酰化狀態參與調控ERS，進而影響肝細胞損傷的發生、發展。

綜上所述，組蛋白乙?；ㄟ^調控ERS參與INH致肝細胞損傷。但組蛋白乙?；瘏⑴cERS的具體作用機制尚不完全清楚，仍需進一步研究。

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