紅霉素對煙草煙霧刺激下人巨噬細胞TNF-α釋放的抑制作用及其機制

邱居烽，李梅華，鐘小寧，文明智，馬南，唐曉娟，黃梅，梁權

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種具有氣流受限特征的肺部疾病，其發病機制與免疫反應、氧化應激、蛋白酶與抗蛋白酶失衡等有關[1]。吸煙可通過多種途徑參與COPD的發生。研究證實，煙草煙霧吸入可誘發氣道炎癥反應，在此過程中巨噬細胞可分泌多種細胞因子和炎癥介質，如TNF-α、IL-8、IL-6等，導致炎癥細胞募集、浸潤和激活，繼而引起氣道結構破壞[2]。近年研究發現，長期小劑量應用大環內酯類抗生素(如紅霉素)可通過抑制炎癥介質的產生而抑制氣道炎癥反應[3,4]。2016年6月～2017年5月，本研究觀察了紅霉素對煙草煙霧提取物(CSE)刺激下人巨噬細胞TNF-α釋放的影響，現分析結果并探討紅霉素抑制氣道炎癥反應的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人類單核細胞株U937(以下稱U937細胞)，購自中國科學院細胞庫。真龍牌過濾型香煙(焦油量15 mg，煙堿量1.2 mg)，廣西卷煙總廠。紅霉素、曲古霉素A(TSA)、佛波酯，美國Sigma公司。ELx800全自動酶標儀，美國BioTek公司；DYY-7C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；5813R高速離心機，艾本德中國有限公司；E-Gel Imager凝膠成像系統，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；TNF-α ELISA檢測試劑盒，美國R&D Systems公司；全蛋白提取試劑盒，美國Pierce公司；兔抗組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)多克隆抗體、兔抗NF-κB多克隆抗體，美國Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG，美國Pierce公司。

1.2 CSE溶液制備 CSE溶液制備參照Mercado等[5]的方法：實驗前1 h，將2支點燃的去過濾嘴香煙連于一抽吸驅動裝置，反復緩慢抽吸，使其煙霧通過10 mL RPMI 1640培養液中制成CSE懸液，調整懸液pH值至7.4，在超凈臺中經0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，即為CSE原液。用RPMI 1640培養液將CSE原液濃度稀釋至10%備用。

1.3 紅霉素、CSE溶液抑制巨噬細胞增殖活性的最佳作用濃度和作用時間篩選 將U937細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640完全培養基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，2～3天傳代。取傳2代對數生長期細胞，接種于96孔板，每孔(0.5～1)×104個，然后加入200 ng/mL佛波酯溶液10 μL，誘導分化24 h即可分化為巨噬細胞[6]。將分化的巨噬細胞分為兩部分，一部分分別加入使細胞干預終濃度為0.1、1、10 μg/mL紅霉素溶液[7]，另一部分分別加入使細胞干預終濃度為0.1%、1%、2.5% CSE溶液，兩部分均設置陰性對照孔，每個濃度設3個復孔；分別于孵育24、48、72 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h，棄去上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩混勻。酶標儀450 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值。以OD450值代表細胞增殖活性。結果見表1、2。結果顯示，2.5% CSE溶液作用24、48、72 h均能明顯抑制巨噬細胞增殖活性(P均<0.05)，而0.1、1、10 μg/mL紅霉素溶液和0.1%、1% CSE溶液對巨噬細胞增殖活性影響不大(P均>0.05)。為使CSE和紅霉素作用于U937細胞時盡可能發揮各自作用，又不影響細胞增殖活性，故選用干預終濃度為1 μg/mL紅霉素溶液和1% CSE溶液、作用時間24 h進行后續實驗。

表1 不同濃度紅霉素溶液作用24、48、72 h巨噬細胞增殖活性比較

注：不同濃度紅霉素溶液細胞增殖活性兩兩比較，P均>0.05。

1.4 細胞分組處理 取傳2代對數生長期U937細胞，接種于含10% FBS RPMI 1640完全培養基的培養瓶中，每瓶(0.5～0.6)×107個，按1.3中的方法誘導分化為巨噬細胞，并隨機分為空白對照組、CSE組、紅霉素+CSE組、TSA組。空白對照組不予處理；CSE組加入1% CSE溶液孵育24 h；紅霉素+CSE組先加入1 μg/mL紅霉素溶液預孵育24 h，再加入1% CSE溶液孵育24 h；TSA組加入100 ng/mL TSA孵育24 h。

表2 不同濃度CSE溶液作用24、48、72 h巨噬細胞增殖活性比較

注：與陰性對照同期比較，*P<0.05；與0.1% CSE溶液同期比較，#P<0.05；與1% CSE溶液同期比較，△P<0.05；與同濃度作用48 h比較，▲P<0.05；與同濃度作用72 h比較，▽P<0.05。

1.5 相關指標觀察

1.5.1 培養液上清TNF-α含量 各組細胞孵育結束，收集培養液，4 000×g離心20 min，留取培養液上清。按ELISA試劑盒說明配置標準品，樣品孔每孔加入100 μL待測樣品，標準品孔每孔加入100 μL倍比稀釋好的標準品，37 ℃溫育2 h；每孔加入生物素標記抗體工作液100 μL，37 ℃溫育 1 h；棄去孔內液體，洗板3次，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素工作液，37 ℃溫育1 h；棄去孔內液體，洗板5次，每孔加入90 μL底物溶液，37 ℃避光顯色30 min，再加入50 μL終止液終止反應。酶標儀450 nm波長處檢測各組OD值。根據標準品OD值繪制標準曲線，計算各組培養液上清TNF-α含量。

1.5.2 細胞HDAC1、NF-κB蛋白表達 采用Western blotting法。各組細胞孵育結束，用預冷的PBS清洗3次，RIPA裂解液提取細胞總蛋白。取細胞總蛋白按4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性，- 80 ℃保存。取變性蛋白50 μg行SDS-PAGE，90 V恒壓2 h，200 mA恒流70 min；電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上，TBST洗膜5 min×5次，用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h；TBST洗膜5 min×5次，分別加入含HDAC1(1∶1 000)或NF-κB(1∶1 000)或β-actin(1∶1 000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜；次日TBST洗膜5 min×5次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，常溫孵育1 h；TBST清洗，暗室中顯影、定影。采用凝膠圖像分析系統分析各蛋白電泳條帶的灰度值。以β-actin為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組培養液上清TNF-α含量比較 空白對照組培養液上清TNF-α含量為(274.96±182.39)pg/mL，CSE組為(744.46±638.38)pg/mL，紅霉素+CSE組為(646.57±603.53)pg/mL。組間兩兩比較P均<0.05。

2.2 各組HDAC1、NF-κB蛋白表達比較 見表3。

表3 各組HDAC1、NF-κB蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與CSE組比較，#P<0.05；與紅霉素+CSE組比較，△P<0.05。

3 討論

研究發現，COPD患者痰中巨噬細胞數量增多，并且能夠通過分泌細胞因子、趨化因子、生長因子等參與炎癥應答及免疫調節，與COPD的發病息息相關[2，8]。煙草煙霧能夠直接激活巨噬細胞釋放細胞因子和炎癥介質，如IL-8、TNF-α、CCL2等，進一步導致炎癥細胞募集和激活，引起炎癥狀態持續和組織損傷[9]。既往研究表明，煙草煙霧通過激活巨噬細胞的核因子轉錄系統(如NF-κB)，促進炎癥介質釋放[10]，從而誘導炎癥。TNF-α作為重要的促炎因子參與炎癥反應中炎癥細胞和炎癥因子的聚集、釋放等，與炎癥的維持和發展密切相關。研究表明，煙草煙霧能刺激人巨噬細胞TNF-α釋放增加[11]。而TNF-α的釋放是由轉錄因子調控的，已有研究證實，TNF-α釋放與NF-κB密切相關，通過鈣蛋白酶抑制劑抑制IκBα活性，可減少NF-κB表達，降低NF-κB依賴的炎癥因子TNF-α釋放[12～14]。

組蛋白去乙酰化酶(HDACs)包括4個組18個亞型，其中Ⅰ型(HDAC1、2、3、8)已被證實在炎癥反應中具有重要作用，其與組蛋白乙酰轉移酶(HATs)作用相反[15]。HATs相關乙酰化作用使得染色質解螺旋至轉錄因子和相應RNA聚合酶結合到DNA上促進轉錄激活，HDACs則通過調節染色質作用增加組蛋白去乙酰化進而抑制轉錄，抑制炎癥應答[15，16]。HDAC1是HDACs的重要亞型，可通過乙酰化作用抑制NF-κB表達和激活，在調節炎癥反應過程中至關重要[17]。

臨床研究證實，紅霉素可作為抗炎和免疫調節劑用于治療慢性肺部疾病，如COPD、彌漫性泛細支氣管炎、支氣管哮喘等。紅霉素可通過增加HDACs表達及活性，抑制炎癥基因轉錄，減少促炎細胞因子生成和白細胞黏附，加速中性粒細胞死亡和清除，在減輕COPD氣道炎癥反應中具有重要作用[7，18]。

本研究觀察了紅霉素對巨噬細胞TNF-α釋放及其對HDAC1、NF-κB蛋白表達的影響。結果顯示，與空白對照組比較，CSE組和紅霉素+CSE組培養液上清TNF-α含量明顯增加；而紅霉素+CSE組培養液上清TNF-α含量較CSE組明顯降低。提示煙草煙霧誘導的炎癥反應可能是通過促使巨噬細胞釋放炎癥介質TNF-α增加導致的，而紅霉素能降低巨噬細胞TNF-α釋放進而發揮抗炎作用。本研究結果顯示，與空白對照組比較，CSE組、紅霉素+CSE組NF-κB蛋白表達升高，HDAC1蛋白表達降低，提示煙草煙霧刺激可能通過抑制HDAC1蛋白表達、激活NF-κB信號通路，繼而引起炎癥應答。TSA是HDAC的特異性抑制劑，本研究以TSA作為陽性對照，結果發現CSE組與TSA組HDAC1蛋白表達均降低，NF-κB蛋白表達均升高，進一步驗證了上述結論。本研究還發現，與CSE組比較，紅霉素+CSE組NF-κB蛋白表達降低，HDAC1蛋白表達上升，提示紅霉素能夠通過恢復HDAC1蛋白表達及降低NF-κB蛋白表達進而發揮抗炎作用。研究證實，煙草煙霧誘導的炎癥反應過程是通過抑制巨噬細胞HDAC1蛋白表達，激活NF-κB信號通路，進而引起TNF-α釋放增加而實現的；紅霉素干預可使巨噬細胞HDAC1蛋白表達上調，抑制NF-κB蛋白表達，NF-κB依賴的TNF-α釋放減少，繼而減輕炎癥反應。我們推測這可能是紅霉素減輕煙草煙霧刺激誘導炎癥反應的分子機制之一。

綜上所述，紅霉素能抑制煙草煙霧刺激下巨噬細胞TNF-α釋放增多，其作用機制可能是通過恢復受煙草煙霧抑制的HDAC1蛋白表達，抑制NF-κB蛋白表達，使NF-κB依賴的TNF-α釋放減少，繼而減輕炎癥反應。本研究為紅霉素用于治療慢性氣道炎癥性疾病提供了實驗依據。

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