靶向線粒體的mt-roGFP2熒光探針檢測人肝癌HepG2細胞線粒體ROS水平動態變化

劉曉寧，薄惠，劉翠娥

(黃河科技學院醫學院，鄭州450063)

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系HepG2、人腎上皮細胞系293T(以下分別稱HepG2細胞、293T細胞)，購自美國ATCC公司。mt-roGFP2質粒載體pLPCX，由Tobias P. Dick教授惠贈。所有引物由本課題組自行設計，委托中國農業科學院合成。MitoTracker?紅色線粒體熒光探針、Lipofectamine?2000，美國Invitrogen公司；青鏈霉素混合液(P/S)、H2O2、DTT，北京索萊寶科技有限公司；聚凝胺、嘌呤霉素，美國Sigma公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司；限制性內切酶EcoR Ⅰ-HF、Xba Ⅰ，美國NEB公司；PCR擴增試劑盒，北京全式金生物技術有限公司；無縫克隆試劑盒、pLenti-CMV-PGK-puro、pVSVg、pRev、pGag-Pol，上海和元生物技術股份有限公司；GAPDH一抗、GFP一抗，上海碧云天生物技術有限公司；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗，美國Santa-Cruz公司。

1.2 pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒載體構建 以pLPCX為模板，設計正向引物5′-CGAGC-TCAAGCTGAATTCGCCACCATGGCCTCCACTCGTGT C-3′和反向引物5′-CGGTAGAATTATCTAGATTACT-TGTACAGCTCGTCC-3′，通過PCR擴增得到mt-roGFP2目的片段。用限制性內切酶EcoR Ⅰ-HF和Xba Ⅰ酶切載體pLenti-CMV-PGK-puro后，瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收，通過無縫克隆試劑盒將目的片段與回收載體連接，得到目的質粒pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro。利用正向引物5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′和反向引物5′-CAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGC-3′對陽性克隆測序鑒定。經鑒定，目的片段已成功構建入載體中。

1.3 mt-roGFP2慢病毒制備及其滴度測定 利用Lipofectamine?2000將慢病毒載體pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro與包裝質粒pVSVg、pRev、pGag-Pol共轉染293T細胞，離心，留取上清液，即mt-roGFP2慢病毒顆粒。為確定制備的慢病毒顆粒感染細胞最佳濃度，將所得慢病毒懸液梯度稀釋后再次感染293T細胞，再次檢測慢病毒滴度。共檢測3次，取平均值。慢病毒滴度(IU/mL)=(C×N×D×1 000)/V，其中C為每基因組整合的病毒拷貝數、N為感染時細胞數目、D為病毒載體稀釋倍數、V為稀釋病毒體積(μL)。

1.4 穩定細胞株篩選 將HepG2細胞接種于含10% FBS和P/S的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。當細胞進入對數生長期時，0.25%胰蛋白酶消化，待細胞收縮變圓，加入適量培養液，制成密度為4×104個/mL的細胞懸液。取細胞懸液接種于24孔板，每孔500 μL，培養至對數生長期，每孔加入上述制備的mt-roGFP2慢病毒顆粒0.99 μL，再加入適量聚凝胺，使其終濃度為5 μg/mL。感染12 h，棄去原培養液，每孔加入2 mL新鮮的培養液。感染72 h，加入適量嘌呤霉素，使其終濃度為2 μg/mL，繼續培養。每隔2天更換1次含2 μg/mL嘌呤霉素的培養液。嘌呤霉素篩選約兩周，奧林巴斯IX71熒光顯微鏡(激發光波長488 nm、發射光波長507 nm)觀察mt-roGFP2表達，Western blotting法鑒定mt-roGFP2表達。將穩定表達mt-roGFP2的HepG2細胞命名為HepG2-mt-roGFP2。

1.5 mt-roGFP2熒光探針的亞細胞定位分析 選擇HepG2-mt-roGFP2細胞，接種于含10% FBS和P/S的DMEM完全培養液，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。培養至對數生長期，取細胞2×104個接種于Nest-35 mm激光共聚焦培養皿，與MitoTracker線粒體熒光探針(終濃度為100 nmol/L)共溫育20 min。使用奧林巴斯FV1000激光共聚焦顯微鏡(激發光波長579 nm，發射光波長599 nm)觀察mt-roGFP2熒光探針的亞細胞定位。

1.6 線粒體ROS的熒光成像分析 取對數生長期HepG2-mt-roGFP2細胞接種于Nest-35 mm激光共聚焦培養皿，置于顯微鏡用活細胞培養系統中。采用尼康A1R激光掃描共聚焦顯微鏡拍攝同一細胞，在拍攝20 s時經0.5 mmol/L H2O2處理，200 s時加入1 mmol/L DTT。設置2個激發光波長(405、488 nm)和1個發射光波長(500～554 nm)。通過Image J軟件分析熒光圖片(http://rsb.info.nih.gov/ij/)，通過設定閾值得到偽彩色比值(405 nm/488 nm)圖片。

2 結果

2.1 mt-roGFP2慢病毒滴度 mt-roGFP2表達載體與pVSVg、pRev和pGag-Pol共轉染293T細胞，包裝產生的mt-roGFP2慢病毒平均滴度為4.04×108IU/mL。見表1。

表1 mt-roGFP2慢病毒滴度

2.2 穩定轉染細胞HepG2-mt-roGFP2構建 mt-roGFP2慢病毒感染HepG2細胞，經嘌呤霉素篩選，得到穩定轉染細胞HepG2-mt-roGFP2。經熒光顯微鏡觀察和Western blotting法鑒定，roGFP2熒光蛋白探針穩定表達在HepG2細胞中，roGFP2熒光蛋白與MitoTracker探針共定位于HepG2細胞線粒體。

2.3 mt-roGFP2熒光探針響應HepG2細胞線粒體ROS水平變化 合并后的熒光圖片(405 nm和488 nm)顯示，HepG2細胞線粒體經歷了還原狀態到氧化狀態再到還原狀態的迅速轉換。外源性氧化劑H2O2的加入導致HepG2細胞線粒體ROS水平明顯升高，其熒光比值(405 nm/488 nm)從1.19上升到3.98，持續約135 s后加入還原劑DTT，可使其熒光比值下降至1.25。見圖1。

3 討論

作為細胞的“能量工廠”，線粒體利用氧氣進行氧化磷酸化，產生三磷酸腺苷，為細胞及生命體提供能量；同時，伴隨著呼吸鏈電子泄露，線粒體成為ROS產生并相互轉化的主要位點。線粒體ROS在維持氧化還原平衡及參與細胞增殖、凋亡調控等方面發揮了至關重要的作用。相比調控細胞內整體ROS水平，調控線粒體ROS可能是一種更為有效的靶向治療腫瘤策略[4]。最近研究報道，靶向線粒體的熒光探針AIE-mito-TPP可選擇性聚集在腫瘤細胞線粒體內，從而降低線粒體膜電位，增加線粒體ROS水平，最終誘導腫瘤細胞凋亡[10]。因此，實時監測線粒體ROS水平對研究線粒體ROS在靶向治療腫瘤中的作用機制至關重要。

圖1 mt-roGFP2探針響應H2O2和DTT引起的HepG2細胞線粒體ROS變化

熒光成像技術具有時空分辨率高、生物相容性好、敏感性高等優勢，已成為實時監測細胞及活體內生物活性分子的有力工具。基于遺傳編碼的roGFP熒光探針通過巰基-二硫鍵轉換能實時成像顯示細胞內氧化還原狀態變化，其最大特征是細胞內氧化還原狀態由兩個激發光波長的熒光比值表示，能降低光漂白作用、探針濃度差異、激光光源穩定性、激發光路以及熒光在細胞內或細胞間分布不一致等造成的實驗誤差[17]。本研究應用的mt-roGFP熒光探針是roGFP探針系列的一種，通過添加線粒體定位序列，將roGFP蛋白在HepG2細胞線粒體內穩定表達，首次實現了對HepG2細胞線粒體ROS水平的實時動態、可逆性和特異性檢測和成像，為研究抗癌藥物所致線粒體ROS水平變化的研究提供了一個新方法。

綜上所述，靶向線粒體的roGFP2熒光探針能夠實時動態、可逆性地檢測HepG2細胞線粒體ROS水平變化并實時成像。這將為闡明氧化還原狀態變化在各種腫瘤細胞生命活動過程中的作用提供了一種新工具。

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