姜黃揮發油聯合順鉑對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖和凋亡的影響及機制

昝雪娟 榮冬蕓 潘軍玲 呂琳娜 肖露 曹煜

550000貴陽，貴州醫科大學（昝雪娟、榮冬蕓、潘軍玲、呂琳娜、肖露）；貴州醫科大學附屬醫院皮膚性病科（曹煜）

順鉑（diamine dichloro platinum）是臨床上廣泛應用的化療藥物，單用或者聯合其他藥物可用于多種腫瘤的治療，但順鉑的劑量依賴性不良反應和耐藥性是有效化療的主要障礙之一。大量研究表明，聯合化療，特別是傳統化療藥聯合中藥，對增加抗癌療效和減輕單藥不良反應具有很大應用價值［1?3］。姜黃揮發油（turmeric volatile oil，TVO）為姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longa L.）的主要提取物，具有抗炎、抗菌、祛痰、止咳、平喘等作用。TVO能有效抑制人皮膚鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）A431細胞增殖，并誘導其凋亡［4］。我們將TVO與順鉑聯合作用于體外培養的人皮膚鱗癌A431細胞，觀察其對A431細胞的抑制作用，探討其相互作用及抑癌機制，為TVO藥物開發及臨床應用提供理論和實驗依據。

材料與方法

一、材料

TVO［貴陽舒美達藥廠，批號：Z20025149，純度80%，規格25 g，將其與二甲基亞砜（DMSO）以100∶1的比例混合，用培養基稀釋成1 g/L，濾過除菌，4℃冰箱保存備用］，注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，批號6M025A89，國藥準字H37021358，規格：10 mg），用DMEM高糖完全培養基將其稀釋為1 g/L，4℃冰箱避光保存備用，A431細胞、CCK8試劑盒、DMEM高糖培養基、吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）雙染細胞凋亡檢測試劑盒（貴陽凱信生物工程有限公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）?3、Caspase?9酶活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究院），ELX800酶聯免疫檢測儀（美國Biotech公司），兔抗人P糖蛋白單克隆抗體（美國Abcam公司），BD FACS Verse流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）。

二、方法

1.細胞培養：用含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養基在37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養A431細胞，每2～3天更換1次培養基，待細胞鋪滿瓶底后，以0.25%胰蛋白酶消化，取對數生長期細胞用于實驗。

2.CCK8法檢測細胞增殖：

（1）不同濃度TVO對A431細胞增殖的影響：取對數生長期A431細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液（1×104/ml），接種于96孔板，每孔加100 μl細胞懸液，待細胞貼壁后，加入TVO，使終質量濃度分別為5、10、20、40、80 mg/L；對照組加入含有1%DMSO的DMEM高糖培養基，每個濃度設4個復孔，CO2培養箱中繼續培養24 h，每孔加入10 μl CCK8試劑，孵育3 h，酶標儀檢測吸光度值（A450），細胞生長抑制率（%）=（對照組A450-實驗組A450）/（對照組A450-空白組A450）×100%。采用Calacusyn軟件計算抑制細胞增殖50%的藥物濃度（IC50）。

（2）TVO與順鉑單獨或聯用對A431細胞增殖的影響：取對數生長期A431細胞，按上述方法接種于96孔板，設對照組、TVO組、順鉑組及TVO+順鉑組。TVO組用40 mg/L TVO［根據“二、2（1）”實驗結果選擇，對A431細胞作用最明顯且在IC50以下］處理，順鉑組用10 mg/L順鉑處理［5］，TVO+ 順鉑組用40 mg/L TVO和10 mg/L順鉑處理，對照組用含有1%DMSO的DMEM高糖培養基處理。繼續培養24 h后，按上述方法測定細胞生長抑制率。計算聯合指數（CI），CI=Eab/（Ea+Eb-Ea×Eb），Ea、Eb分別為單藥作用抑制率，Eab為TVO+順鉑組細胞的抑制率。CI＞ 1為協同，1為相加，＜ 1為拮抗［6］。

3.細胞形態學變化：用完全DMEM高糖培養基調整對數生長期A431細胞密度為1×106/ml，接種至6孔板，每孔2 ml，置于37℃、5%CO2培養箱中培養12 h后，按“二、2（2）”分組處理細胞，培養24 h后，倒置顯微鏡觀察細胞形態。

4.AO/EB雙染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡：用完全DMEM高糖培養基調整對數生長期A431細胞密度為1×106/ml，接種到6孔板，置于37℃、5%CO2培養箱中培養12 h后，按“二、2（2）”中分組處理細胞24 h后，吸棄培養液，加入AO/EB染液4℃避光染色15 min，吸棄染液，PBS洗滌，熒光顯微鏡觀察、拍照。

5.Caspase?3、Caspase?9 酶活性檢測：細胞培養及分組方法同“二、2（4）”，處理24 h后，離心收集細胞，加入50 μl裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min，期間渦旋3～4次，12 000×g、4℃離心10～15 min，吸取上清液，按照試劑盒說明書操作，37℃孵育4 h，用酶標儀檢測405 nm波長處A值。Caspase?9（或Caspase?3）酶活性 = 實驗組A405/對照組A405。

6.Caspase?3、P糖蛋白表達檢測：采用 Western印跡法。按“二、2（4）”中分組處理24 h。收集細胞，PBS洗2次，裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。將含有等量蛋白的細胞裂解液用5×上樣緩沖液稀釋，置于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗（1∶1 000）4℃過夜；加堿性磷酸酶標記的二抗（1∶500）37℃孵育1 h，顯色液顯色后掃描成像。以β肌動蛋白的表達量為對照，計算并比較Caspase?3及P糖蛋白的相對表達量。

三、統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件。計量數據以±s表示，同一時段不同濃度TVO組間比較采用單因素方差分析，聯合用藥組與單藥組間比較采用雙因素方差分析，組間兩兩比較采樣LSD?t檢驗；細胞增殖抑制率與藥物濃度間的關系采用直線相關分析方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、TVO對A431細胞增殖抑制率的影響

A431細胞經不同濃度TVO作用24 h后，5、10、20、40、80 mg/L TVO對A431細胞增殖抑制率分別是12.83% ±6.4%、16.27% ±11.4%、21.61% ±9.1%、33.11%±2.0%、46.00%±3.3%，與對照組（4.03%±1.4%）相比差異均有統計學意義（P＜0.05）。隨著TVO濃度增高，A431細胞增殖抑制率逐漸升高，且在一定濃度范圍內呈劑量依賴關系（r=0.657，P＜0.05）。24 h時TVO的IC50為（61.66±1.03）mg/L。

二、TVO和順鉑對A431細胞增殖的影響

A431細胞經TVO或（和）順鉑作用24 h后，細胞增殖均受到不同程度抑制，TVO與順鉑聯用組與TVO組、順鉑組相比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。40 mg/L TVO與10 mg/L順鉑聯用后CI值為1.366。

三、TVO與順鉑對A431細胞形態的影響

TVO與順鉑單獨或聯合作用A431細胞24 h后，倒置顯微鏡觀察顯示，對照組A431細胞呈條索狀或多角形，貼壁生長緊密，形態一致，均質性，較透亮，折光性強，細胞排列均勻；TVO組貼壁細胞數量減少，細胞形態欠規則，細胞間隙略增大，部分呈長梭形，部分細胞變圓，折光度下降；順鉑組貼壁細胞數量大量減少，形態不規則，部分細胞皺縮、變圓，細胞內顆粒增多；TVO+順鉑組細胞已無正常細胞形態，單位面積細胞數明顯減少，出現小片狀無細胞生長區，部分細胞裂解成細胞碎片，并有大量漂浮細胞。

圖1 熒光顯微鏡下觀察各組A431細胞凋亡（×200） 1A：對照組細胞核較大，核膜完整；1B：姜黃揮發油組可見少量細胞核染色質著黃色或橙黃色的早期凋亡細胞；1C：順鉑組可見大量黃色熒光和橘紅色熒光；1D：姜黃揮發油+順鉑組細胞密度下降，可見橘紅色壞死細胞及碎片

四、TVO與順鉑對細胞凋亡的影響

見圖1。AO/EB雙染色觀察顯示，TVO與順鉑單獨或聯合作用A431細胞24 h后，對照組細胞數目較多，且為活細胞，核染色質染成綠色，形狀均勻；TVO組部分細胞核染色質染成黃色或橙黃色的早期凋亡細胞；順鉑組中可見細胞核染色質著橙黃色熒光的早期凋亡細胞和著橘紅色熒光的晚期凋亡細胞；TVO+順鉑組細胞密度明顯下降，可見大量細胞核染色質呈橘紅色，并可見橘紅色壞死細胞及碎片。

表1 姜黃揮發油（TVO）和順鉑單獨或聯合對A431細胞增殖和Caspase?3、9活性以及Caspase?3蛋白和P糖蛋白表達的影響（±s）

表1 姜黃揮發油（TVO）和順鉑單獨或聯合對A431細胞增殖和Caspase?3、9活性以及Caspase?3蛋白和P糖蛋白表達的影響（±s）

注：n=4；與對照組相比，aP＜0.05；與TVO組相比，bP ＜0.05；與順鉑組相比，cP ＜0.05

組別對照組TVO組順鉑組TVO+順鉑組增殖抑制率（%）0.8±0.3 3.9±1.3a 23.3±7.6a 36.2±9.3a b c Caspase?3活性0.028±0.012 1.117±0.095a 1.381±0.089a 1.520±0.115a b c Caspase?9活性0.056±0.001 1.259±0.059a 1.829±0.171a 2.760±0.297a b c Caspase?3蛋白0.339±0.011a 1.156±0.006a 1.296±0.021a 1.482±0.016a b c P糖蛋白1.522±0.002a 1.311±0.011a 1.169±0.012a 0.528±0.014a b c

五、TVO 與順鉑對 A431細 胞 Caspase?3、Caspase?9 活性的影響

TVO與順鉑單獨或聯合作用A431細胞24 h后，TVO組、順鉑組及TVO+順鉑組中A431細胞Caspase?3、Caspase?9 酶活性較對照組均增強，且TVO+順鉑組高于TVO組、順鉑組（均P＜0.01）。見表1。

六、TVO與順鉑對A431細胞Caspase?3、P糖蛋白表達的影響

見表1、圖2。TVO+順鉑組P糖蛋白表達量明顯低于TVO組、順鉑組，TVO+順鉑組Caspase?3表達量均明顯高于TVO組、順鉑組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

圖2 不同濃度姜黃揮發油（TVO）對A431細胞中P糖蛋白、Caspase?3蛋白表達的影響

討 論

順鉑是一種金屬鉑類化合物，可結合癌細胞DNA，干擾其復制，達到破壞DNA結構和功能的效果。順鉑被公認為是治療多種腫瘤（包括皮膚鱗癌）的一線用藥，但因其毒性大、易耐藥，在臨床上多以鉑類藥物為基礎制定聯合治療方案［7?9］。因此尋找能夠增敏順鉑且減輕其毒性和不良反應的新型藥物有重要臨床意義。腫瘤細胞耐藥性的產生是一個多因素參與的復雜過程，其中P糖蛋白的過度表達是引起多藥耐藥（MDR）的主要機制［10?11］。P糖蛋白由多藥耐藥基因mdr1編碼，是一種相對分子質量為170 000的跨膜糖蛋白（P170），位于細胞膜上，作為識別蛋白不停地篩查外來疏水分子，這些分子包括許多有害物質，也包括一些很重要的物質，如順鉑、環孢素等其他抗癌藥，它具有能量依賴性“藥泵”功能，可使細胞內藥物泵出細胞外，降低細胞內藥物濃度使細胞產生耐藥性。此外，P糖蛋白還可使細胞內藥物再分布從而進一步減少靶點部位藥物濃度［12］。P糖蛋白在腫瘤細胞耐藥株中的表達水平較普通細胞株顯著上調［13?14］，可使腫瘤細胞抗凋亡能力增強。近年有研究表明，P糖蛋白可能通過一些信號通路參與腫瘤MDR發生［15?16］，如抑制Fas系統，激活Caspase?8活性［17］，同時抑制線粒體膜電位下降［18］。此外，P糖蛋白還可直接進行凋亡抑制，延遲凋亡級聯反應，抑制Caspase?3激活，進而抑制Caspase依賴型凋亡［19］。還有研究顯示，活化的Caspase?3能通過分解DNA蛋白激酶來更加顯著地抑制DNA?PKcs/Akt/GSK?3β信號通路，從而降低P糖蛋白的表達［20］。

本研究結果顯示，隨著濃度增加，TVO對細胞增殖的抑制作用增強，呈一定程度劑量依賴關系，進一步證實TVO能有效抑制人皮膚鱗癌A431細胞增殖［4］；同時，TVO與順鉑聯用對A431細胞的增殖抑制作用強于TVO或順鉑單用，兩藥具有明顯的協同作用。而且，TVO+順鉑組凋亡、死亡細胞明顯增加，多無正常細胞形態，Caspase?3和Caspase?9活性升高，由于Caspase?9是線粒體通路凋亡的關鍵蛋白酶，提示線粒體通路參與凋亡過程。TVO+順鉑組P糖蛋白表達明顯降低，而Caspase?3蛋白表達明顯增加，提示TVO可能通過降低P糖蛋白的表達或影響其功能，同時誘導Caspase?3激活，抑制A431細胞對順鉑產生MDR，促進順鉑誘發腫瘤細胞凋亡。

總之，TVO不僅自身可抑制A431細胞增殖，與順鉑可以發揮協同抗A431細胞作用，其可能是通過線粒體介導的內源性途徑發揮作用，與活化Caspase系統及降低P糖蛋白表達相關，但確切的分子機制尚待進一步探討。

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