天皰瘡患者皮損局部B淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)生特異性抗體的功能研究

元慧杰 周生儒 劉芝翠 朱海琴 許人超 鄭捷 潘萌

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科

天皰瘡是一種以皮膚、黏膜為靶器官的自身免疫性大皰性皮膚病，通常認(rèn)為外周血循環(huán)中的特異性抗橋粒芯糖蛋白1（desmoglein1，Dsg1）和（或）Dsg3抗體通過破壞角質(zhì)形成細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致局部棘層松解，形成表皮內(nèi)水皰［1］。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為［2?3］，天皰瘡的致病性自身抗體來源于外周血循環(huán)中的B細(xì)胞，皮膚僅作為靶器官而發(fā)生疾病。因此，目前對(duì)于天皰瘡免疫機(jī)制的研究多集中于外周血B淋巴細(xì)胞及其自身抗體的致病性［4?5］，而皮損局部的免疫應(yīng)答反應(yīng)則未曾有報(bào)道。為明確天皰瘡患者皮損局部是否存在抗原特異性B淋巴細(xì)胞的浸潤，是否可以在局部產(chǎn)生特異性抗體，我們對(duì)尋常型天皰瘡患者皮損局部B淋巴細(xì)胞的表型及其功能進(jìn)行探討。

一、對(duì)象與方法

（一）對(duì)象：2013年9月至2015年6月初診、未經(jīng)治療并隨訪于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科的35例尋常型天皰瘡患者（皮膚黏膜型），均根據(jù)臨床表現(xiàn)、組織病理、免疫熒光和自身抗體檢測確診。健康對(duì)照皮膚組織來自皮膚科門診手術(shù)室接受色素痣切除術(shù)的22例患者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

（二）主要試劑和儀器：別藻藍(lán)蛋白（APC）-抗人CD19、異硫氰酸熒光素（FITC）-抗人IgG流式抗體產(chǎn)自美國BD公司，Alexa?Fluor?647-抗人DYKDDDDK標(biāo)簽抗體、藻紅蛋白（PE）-抗人His標(biāo)簽抗體產(chǎn)自美國CST公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、透明質(zhì)酸酶、DNA酶及Ⅴ型膠原酶產(chǎn)自美國Sigma?Aldrich公司，抗人Dsg1、Dsg3抗體ELISA試劑盒產(chǎn)自日本MBL公司，LymphoprepTM淋巴細(xì)胞分離液產(chǎn)自挪威Axis?shield公司。FACS CantoⅡ及LSR Fortessa型流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。重組人Dsg1、Dsg3由清泓生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

（三）方法：

1.皮損局部單個(gè)核細(xì)胞分離：取12例健康對(duì)照正常皮膚和20例尋常型天皰瘡患者初發(fā)水皰或糜爛皮損組織各1 cm×1 cm，在含Ⅴ型膠原酶、DNA酶及透明質(zhì)酸酶的消化液中37℃消化2 h，用淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法（800×g，15 min）分離獲得單個(gè)核細(xì)胞。

2.流式細(xì)胞儀檢測CD19+B細(xì)胞、CD19+IgG+B細(xì)胞、CD19+CD27+記憶B細(xì)胞及CD19+IgD+初始B細(xì)胞：每2×105個(gè)皮損單個(gè)核細(xì)胞重懸于100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清）中，根據(jù)不同流式抗體組合，按照抗體與培養(yǎng)液的體積比例1∶100分別加入熒光抗體，用FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀和FlowJo軟件檢測和分析。

3.流式細(xì)胞儀檢測表面識(shí)別Dsg1、Dsg3的CD19+B細(xì)胞：每2×105個(gè)皮損單個(gè)核細(xì)胞重懸于100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清）中，分別加入0.5 μg重組人Dsg1和Dsg3，室溫孵育1 h，培養(yǎng)液洗滌1次，根據(jù)不同流式抗體組合，按照抗體與培養(yǎng)液的體積比例1∶100分別加入熒光抗體，用FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀和FlowJo軟件檢測和分析。

4.皮損局部單個(gè)核細(xì)胞的體外培養(yǎng)及上清液中抗Dsg1、抗Dsg3抗體檢測：每2 × 105個(gè)細(xì)胞重懸于200 μl含10%胎牛血清、200 mg/L青霉素和200 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6 d后收集上清液。

按照ELISA試劑盒的抗體檢測說明，將上清液按1∶101稀釋后加入微孔中，于室溫孵育1 h后洗滌，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗人IgG抗體，于室溫孵育1 h，洗滌孔板后再加入底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）于室溫孵育0.5 h，加入終止液終止反應(yīng)，采用全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取吸光度（A值），并通過試劑盒說明中的公式（A樣本-A陰參）×100%/（A陽參-A陰參）計(jì)算培養(yǎng)上清液中抗體的滴度值。

采用受試者工作特征曲線（ROC）判斷皮損處單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的有效性［6］，根據(jù)ROC統(tǒng)計(jì)分析輸出的靈敏度與特異度，計(jì)算約登指數(shù)（靈敏度+特異度-1），約登指數(shù)最大值所對(duì)應(yīng)的滴度值為臨界值，抗體滴度大于臨界值即為陽性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用Graphpad 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示；用非參數(shù)Mann?WhitneyU檢驗(yàn)及Welch′sT檢驗(yàn)比較兩組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）尋常型天皰瘡患者皮損局部B淋巴細(xì)胞比例：流式細(xì)胞儀檢測15例（分離的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)≥2×105）尋常型天皰瘡患者皮損及12例健康對(duì)照皮膚分離后的單個(gè)核細(xì)胞，患者組淋巴細(xì)胞比例為（17.95±3.85）%，健康對(duì)照組為（7.83±1.29）%（圖1A），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.49，P=0.023 4）。患者組CD19+B細(xì)胞比例為（4.27±1.13）%，健康對(duì)照組為（0.61± 0.31）%（圖1B），差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=13.00，P=0.000 2）。

（二）患者皮損局部CD19+B細(xì)胞為Dsg特異性B細(xì)胞：15例天皰瘡患者皮損局部CD19+B淋巴細(xì)胞中，表達(dá)IgG的細(xì)胞比例為（38.33±5.56）%，3例天皰瘡患者皮損局部CD19+B淋巴細(xì)胞中表面特異性識(shí)別Dsg1與Dsg3的細(xì)胞比例分別為（12.87 ± 1.267）%、（10.42 ± 1.243）%。

（三）尋常型天皰瘡患者皮損局部單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)后產(chǎn)生抗Dsg1及抗Dsg3特異性抗體：將20例尋常型天皰瘡患者皮損與10例健康對(duì)照皮膚局部單個(gè)核細(xì)胞分別體外培養(yǎng)6 d后，患者組培養(yǎng)上清液中抗Dsg1與Dsg3抗體滴度分別為（4.89 ± 1.56）、（35.45 ± 13.03）U/ml，健康對(duì)照組分別為（-0.36 ± 0.25）U/ml、（-0.29 ± 0.29）U/ml，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U值為13.0、5.0，P＜0.05）。培養(yǎng)上清液中抗Dsg1和Dsg3抗體的曲線下面積分別為0.938與0.975（圖2），滴度臨界值分別為0.64和0.92。患者皮損單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液抗Dsg1和Dsg3抗體分別有17例（85%）、19例（95%）為陽性。

三、討論

我們在臨床上觀察到，一些復(fù)發(fā)天皰瘡患者的皮損通常發(fā)生在與初發(fā)皮疹完全相同的部位，對(duì)復(fù)發(fā)患者不增加系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素用量，僅加強(qiáng)外用治療，皮疹就能得到控制；而部分落葉型或紅斑型天皰瘡患者，僅外用糖皮質(zhì)激素治療，皮疹也可好轉(zhuǎn)。這引起了我們對(duì)天皰瘡患者皮損局部免疫環(huán)境研究的興趣。

過去的研究認(rèn)為，B淋巴細(xì)胞通常不在皮膚聚集［7］。但在炎癥性皮膚病的動(dòng)物模型及人類臨床研究中發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞可發(fā)揮促炎及抗炎作用［8］。目前已在皮膚利什曼病［9］、彌漫性皮膚硬化［10］和特應(yīng)性皮炎［11］等皮損真皮部位發(fā)現(xiàn)有B細(xì)胞浸潤，B細(xì)胞與皮膚固有免疫細(xì)胞及T細(xì)胞相互作用共同參與皮膚炎癥發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞浸潤于天皰瘡患者皮損局部，這可能是因?yàn)槠p部位基質(zhì)細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞表達(dá)趨化因子（CXCL13、CCL19等）與B細(xì)胞表面的趨化因子受體（CXCR5或CCR7）結(jié)合，趨化B細(xì)胞至患者皮損部位［12?14］。

圖1 尋常型天皰瘡患者皮損處與健康對(duì)照皮膚單個(gè)核細(xì)胞中淋巴細(xì)胞與CD19+B細(xì)胞的比例 1A：淋巴細(xì)胞比例；1B：CD19+B細(xì)胞比例

圖2 體外培養(yǎng)局部單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生抗橋粒芯糖蛋白1（Dsg1）、Dsg3抗體的受試者工作特征曲線 曲線下面積分別為0.938、0.975

皮膚局部的免疫過程可能受到機(jī)體整體免疫的影響，而Geherin等［15］在綿羊肉芽腫模型中發(fā)現(xiàn)，皮膚中聚集的B細(xì)胞表型不同于淋巴結(jié)中的B細(xì)胞，其表面MHCⅡ、CD1和CD80/86表達(dá)增加，有利于T細(xì)胞活化，同時(shí)皮損局部B細(xì)胞和抗體產(chǎn)生細(xì)胞的聚集增加了局部抗體的濃度，進(jìn)而加重了自身免疫的發(fā)生。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，尋常型天皰瘡患者皮損局部浸潤的B細(xì)胞表面高表達(dá)IgG，可與Dsg1與Dsg3特異性結(jié)合，可能是由于局部的T、B細(xì)胞容易被活化。Mahanonda等［16］發(fā)現(xiàn)，正常齒齦及齒齦炎組織有CD20+/27+記憶性B細(xì)胞浸潤，表面表達(dá)IgG和IgA，在體外用Toll樣受體7/8（R848）及白細(xì)胞介素2刺激后可分化為分泌IgG和IgA的抗體分泌細(xì)胞。本研究中，天皰瘡患者皮損局部浸潤的B細(xì)胞，體外培養(yǎng)6 d后產(chǎn)生抗Dsg1和Dsg3抗體，提示浸潤的B細(xì)胞可分化成為抗體分泌細(xì)胞，可能參與天皰瘡的發(fā)生。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，尋常型天皰瘡患者皮損局部有大量淋巴細(xì)胞浸潤，其中包括B淋巴細(xì)胞，這些B細(xì)胞表面表達(dá)IgG，并以記憶性B細(xì)胞為主，可與Dsg1、Dsg3特異性結(jié)合，在體外培養(yǎng)后，可產(chǎn)生抗Dsg1與Dsg3特異性抗體，在皮損形成過程中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

［1］Stanley JR.Autoantibodies against adhesion molecules and structures in blistering skin diseases［J］.J Exp Med,1995,181（1）:1?4.

［2］Hertl M,Veldman C.Pemphigus??paradigm of auto?antibody?mediated autoimmunity［J］.Skin Pharmacol Appl Skin Physiol,2001,14（6）:408?418.doi:10.1159/000056375.

［3］Hertl M.Humoral and cellular autoimmunity in autoi?mmune bullous skin disorders［J］.Int Arch Allergy Immunol,2000,122（2）:91?100.doi:10.1159/000024364.

［4］Payne AS,Ishii K,Kacir S,et al.Genetic and functional characterization of human pemphigus vulgaris mono?clonal autoantibodies isolated by phage display［J］.J Clin Invest,2005,115（4）:888?899.doi:10.1172/JCI24185.

［5］Yamagami J,Takahashi H,Ota T,et al.Genetic characterization of human Dsg3?specific B cells isolated by flow cytometry from the peripheral blood of patients with pemphigus vulgaris［J］.J Dermatol Sci,2008,52（2）:98?107.doi:10.1016/j.jdermsci.2008.05.002.

［6］Messingham KA,Noe MH,Chapman MA,et al.A novel ELISA reveals high frequencies of BP180?specific IgE production in bullouspemphigoid［J］.JImmunolMethods,2009,346（1?2）:18?25.doi:10.1016/j.jim.2009.04.013.

［7］Gaspari AA,Tyring SK.Clinical and basic immunoderma?tology［M］.London:Springer London,2008:17?29.

［8］Egbuniwe IU,Karagiannis SN,Nestle FO,et al.Revisiting the role of B cells in skin immune surveillance［J］.Trends Immunol,2015,36（2）:102?111.doi:10.1016/j.it.2014.12.006.

［9］Geiger B,Wenzel J,Hantschke M,et al.Resolving lesions in human cutaneous leishmaniasis predominantly harbour chemokine receptor CXCR3?positive T helper 1/T cytotoxic type 1 cells［J］.Br J Dermatol,2010,162（4）:870?874.doi:10.1111/j.1365?2133.2009.09573.x.

［10］Lafyatis R,Kissin E,York M,et al.B cell depletion with rituxi?mab in patients with diffuse cutaneous systemic sclerosis［J］.Arthritis Rheum,2009,60（2）:578?583.doi:10.1002/art.24249.

［11］Simon D,H?sli S,Kostylina G,et al.Anti?CD20（rituximab）treatment improves atopic eczema［J］.J Allergy Clin Immunol,2008,121（1）:122?128.doi:10.1016/j.jaci.2007.11.016.

［12］van de Pavert SA,Mebius RE.New insights into the development of lymphoid tissues［J］.Nat Rev Immunol,2010,10（9）:664?674.doi:10.1038/nri2832.

［13］Aloisi F,Pujol?Borrell R.Lymphoid neogenesis in chronic inflam?matory diseases［J］.Nat Rev Immunol,2006,6（3）:205?217.doi:10.1038/nri1786.

［14］Jones GW,Hill DG,Jones SA.Understanding immune cells in tertiary lymphoid organ development:it is all starting to come together［J］.Front Immunol,2016,7:401.doi:10.3389/fimmu.2016.00401.

［15］Geherin SA,Fintushel SR,Lee MH,et al.The skin,a novel niche for recirculating B cells［J］.J Immunol,2012,188（12）:6027 ?6035.doi:10.4049/jimmunol.1102639.

［16］Mahanonda R,Champaiboon C,Subbalekha K,et al.Human memory B cells in healthy gingiva,gingivitis,and periodontitis［J］.J Immunol,2016,197（3）:715 ?725.doi:10.4049/jimmunol.1600540.