光老化對皮膚成纖維細胞降解晚期糖基化終末產物的影響

許新雅 鄭躍 許慶芳 黎鈺瑩 黃云芬 龔子鑒 陸春 賴維

510630廣州，中山大學附屬第三醫院皮膚科

晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE）是蛋白質、脂類、核酸等大分子物質的游離氨基與還原糖通過非酶糖化反應生成不易降解的大分子棕色產物［1］。研究發現，AGE在光老化皮膚中大量堆積，并在光老化多個環節中起重要作用［2］，但其堆積機制不明。研究發現，通過胞外途徑不能降解光老化皮膚組織中AGE，基質金屬蛋白酶在光老化皮膚和皮膚成纖維細胞中表達和活性升高，但依然不能降解AGE［3］；胃蛋白酶和蛋白酶K能降解AGE，但它們只存在于胃腸消化系統中［4］。然而，AGE可被巨噬細胞、成纖維細胞等胞吞后被溶酶體或泛素蛋白酶體降解清除［5］。光老化皮膚成纖維細胞是否對吞入胞內AGE的降解變緩，進而在皮膚AGE堆積中起作用，目前還不清楚。我們檢測AGE-牛血清白蛋白（BSA）在光老化/非光老化成纖維細胞內堆積和降解情況，探討光老化皮膚AGE堆積機制。

材料與方法

一、材料

1.皮膚成纖維細胞：正常皮膚組織來自中山大學附屬第三醫院泌尿外科3名兒童包皮環切術后包皮組織，年齡5～9歲。本研究通過中山大學附屬第三醫院醫學倫理委員會批準，患兒家屬均簽署知情同意書。

2.試劑和儀器：DMEM高糖培養基、胰酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）及青、鏈霉素均為美國Gibco公司產品；AGE?BSA為美國Biovision公司產品；細胞衰老β半乳糖苷酶（SA?β?Gal）試劑盒為美國Cell signaling technology公司產品；LysoTracker RedDND?99為美國ThermoFisher公司產品；SYTO?13為美國Life Technologies公司產品；細胞凋亡試劑盒為南京凱基生物科技發展有限公司產品。UVA紫外線照射儀（Sigma SS?03A，燈管為 Philips UVA TL10RS，波長320～400 nm）與UVA照射計均產自上海希格瑪高科技有限公司。流式細胞儀（美國BD Biosciences公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）。

二、方法

1.原代皮膚成纖維細胞培養：取兒童包皮參照文獻［6］分離培養皮膚成纖維細胞，第3代細胞凍存。細胞復蘇后10代以內的細胞行后續實驗。在AGE?BSA處理細胞3 d前及AGE?BSA孵育細胞過程中，均以含2%胎牛血清的細胞培養液培養各組細胞。

2.連續UVA照射誘導成纖維細胞光老化：實驗分為連續UVA照射組和空白對照組。將3～10代成纖維細胞按1×106/皿接種于直徑6 cm的細胞培養皿，待細胞長到70%融合時，吸棄培養液，PBS洗滌2次后每皿加2 ml PBS。將UVA照射組細胞置于UVA輻照儀下，細胞距離光源15 cm，平均照射功率為12.7 mW/cm2，設置單次照射時間為780 s，照射劑量為9.9 J/cm2［7?9］，每日同一時間照射1次，連續照射14 d。空白對照組細胞加入PBS后置于超凈臺避光。

3.CCK8法檢測皮膚成纖維細胞增殖活性：將末次UVA照射后成纖維細胞按5×103個/孔接種于96孔培養板中，每孔含100 μl細胞培養液，每組各設3個復孔。細胞培養24 h后，每孔加10 μl CCK8試劑，37℃孵育4 h，在酶聯免疫檢測儀上測定450 nm處吸光度（A值）。細胞活性（%）=（AUVA照射組-A空白孔）/（A對照組-A空白孔）×100%，實驗重復3次，取均值。

4.β半乳糖苷酶染色檢測老化比率：末次UVA照射后48 h去除細胞培養基，PBS洗滌1次，按照試劑盒說明書檢測細胞老化。光鏡下觀察結果，老化細胞胞質被染成藍色，每皿至少計數500個細胞，計算陽性細胞所占百分比。實驗重復3次，取均值。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡率：末次UVA照射后，用胰酶消化細胞，調整細胞為1×106/ml。每組取1 ml細胞，預冷PBS洗滌3次后細胞重懸于200 μl結合緩沖液。加入10 μl膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素及10 μl碘化丙錠，輕輕混勻，4℃反應30 min。加入300 μl結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次，取均值。

6.流式細胞儀檢測吞入胞內的AGE?BSA在光老化/非光老化成纖維細胞內的堆積：因AGE?BSA具有自發性熒光，激發光波長（λex）為370 nm、發射光波長（λem）為440 nm，可用流式細胞儀檢測細胞在該波長下的熒光強度以定量胞內AGE?BSA。取原代成纖維細胞分為4組：光老化組（以UVA照射誘導光老化），非光老化組（不做處理），光老化+AGE組（以UVA照射誘導光老化后加入AGE?BSA孵育），非光老化+AGE組（未誘導光老化細胞中加入AGE?BSA孵育）。參照前期研究［10］，200 mg/L AGE?BSA是最大無細胞毒性濃度。在各組細胞中加或不加入200 mg/L AGE?BSA，孵育4、8、16、24、48、72 h收集細胞，預冷PBS洗滌3次，200 μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測并記錄激發波長370 nm處熒光。實驗重復3次，取均值。

7.激光共聚焦定位、半定量細胞內AGE?BSA：分組同上。流式細胞儀檢測發現，在AGE?BSA孵育8 h時，光老化和未老化細胞內AGE?BSA含量最高，因此在孵育8 h時檢測各組細胞內AGE?BSA。PBS洗滌細胞2次后，加入含有70 nmol/L LysoTracker Red DND?99（標記溶酶體膜）的細胞培養基避光孵育1 h，PBS洗滌3次，再加入含有125 nmol/L SYTO 13（標記細胞核）的培養基避光孵育30 min，PBS洗滌3次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，每皿隨機取3個無重疊視野拍攝并計算AGE?BSA平均熒光強度（油鏡，×63）。在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到3種熒光：AGE?BSA呈藍色，LysoTracker Red DND?99標記的溶酶體呈紅色，SYTO13標記的細胞核呈綠色。實驗重復3次，取均值。

8.ELISA檢測吞入胞內的AGE?BSA在光老化/非光老化細胞內降解差異：分組同上。在各組細胞中加入或不加入200 mg/L AGE?BSA，孵育8 h后去除AGE?BSA，繼續培養細胞24 h，收集8 h和32 h點各組細胞總蛋白并定量。按照AGE ELISA檢測試劑盒說明操作，最后根據各樣品的A405值計算AGE濃度。根據（T8h-T32h）/T8h計算AGE?BSA在各組細胞中的降解率。實驗重復3次取均值。

9.統計學處理：采用SPSS 20.0統計軟件，各組數據均以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），各組間兩兩比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、連續UVA照射對成纖維細胞老化及凋亡的影響

UVA照射組細胞活性為（78±6.1）%，較對照組（100%）明顯下降（t=7.559，P＜0.05）。UVA照射組和對照組β半乳糖苷酶染色陽性率分別為（81.37±2.90）%和（8.03±0.31）%，前者顯著高于后者（t=43.524，P＜0.05）。UVA照射組細胞凋亡率為（20±2.5）%，顯著高于對照組細胞［（10± 1.1）%，t=14.075，P＜ 0.05］。

二、吞入胞內AGE?BSA在光老化/非光老化成纖維細胞內堆積差異

圖1 流式細胞儀檢測晚期糖基化終末產物-牛血清白蛋白在光老化/非光老化成纖維細胞內的堆積差異

見圖1。200 mg/L AGE?BSA孵育成纖維細胞后，光老化和非光老化成纖維細胞內AGE?BSA熒光強度均逐漸升高，在8 h點達到最高，此后逐漸下降，24 ～ 72 h間變化差異無統計學意義。4、8、16、24、48、72 h時光老化+AGE組、非光老化+AGE組AGE?BSA熒光強度均顯著高于相應時間點無AGE?BSA孵育的光老化組及非光老化組（均P＜0.05）；光老化細胞內AGE?BSA熒光強度顯著高于非光老化細胞（P＜0.05）。

三、激光掃描共聚焦顯微鏡定位、半定量細胞內AGE?BSA

見圖2。激光掃描共聚焦顯微鏡鏡下發現，細胞內發藍色熒光的AGE?BSA與發紅色熒光的溶酶體位置一致，表明吞入胞內AGE?BSA主要位于溶酶體內。用ImageJ圖像分析軟件行灰度掃描半定量藍色熒光，光老化+AGE組、光老化組、非光老化+AGE組、非光老化組AGE?BSA熒光強度分別為292.63 ± 2.58、227.33 ± 1.11、249.33 ± 0.71、182.73 ±2.22，各組間差異有統計學意義（F=1887.25，P＜0.05）。LSD?t檢驗發現，光老化+AGE組顯著高于其他3組（均P＜0.05），非光老化+AGE組顯著高于非光老化組（P＜0.05）。

四、AGE?BSA在光老化/非光老化細胞內降解差異

見表1。孵育32 h時光老化細胞AGE濃度較8 h下降（7.6±1.4）%，而非光老化細胞AGE濃度下降（14.6±1.2）%，前者顯著低于后者（t=6.604，P＜0.05）。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察晚期糖基化終末產物-牛血清白蛋白（AGE?BSA）在光老化/非光老化成纖維細胞內的堆積（油鏡，× 63） 藍色：AGE?BSA，紅色：溶酶體

表1 AGE?BSA在光老化/非光老化成纖維細胞內的降解差異（±s）

表1 AGE?BSA在光老化/非光老化成纖維細胞內的降解差異（±s）

注：n=3。AGE?BSA，晚期糖基化終末產物-牛血清白蛋白

組別非光老化組非光老化+AGE組光老化組光老化+AGE組AGE（ng/mg）8 h 275.80±5.53 421.24±8.04 321.67±3.90 495.27±8.60降解率（%）32 h 274.23±5.58 359.83±8.83 320.60±3.83 457.43±14.39 0.57±0.14 14.60±1.20 0.33±0.90 7.60±1.40

討 論

研究顯示，AGE在光老化皮膚大量堆積［2］，可促進活性氧簇生成和抑制超氧化物歧化酶活性［1］，促進角質形成細胞和成纖維細胞凋亡，上調基質金屬蛋白酶表達，使膠原纖維和彈性纖維變性，與細胞表面受體結合后引發生物學效應等，進而在光老化中起重要作用。因此，越來越多的學者認為干預AGE堆積可以改善光老化［11?12］。然而，光老化皮膚AGE堆積機制目前還不明確。

本研究顯示，以無細胞毒性劑量UVA連續照射成纖維細胞，細胞活性顯著下降，而β半乳糖苷酶染色陽性率和細胞凋亡率均顯著升高，表明連續UVA照射可成功誘導成纖維細胞光老化。接著，我們驗證光老化/非光老化皮膚成纖維細胞是否可胞吞胞外AGE，發現AGE?BSA孵育的光老化和非光老化細胞內AGE?BSA熒光強度均分別顯著高于無AGE?BSA孵育的光老化及非光老化細胞，且光老化細胞內AGE?BSA熒光強度顯著高于非光老化細胞；共聚焦顯微鏡定位發現，吞入胞內的AGE?BSA主要位于溶酶體內。以上結果表明，光老化和非光老化成纖維細胞均可胞吞胞外AGE?BSA，并將吞入胞內的AGE?BSA輸送至溶酶體內降解，提示成纖維細胞很可能在皮膚AGE降解及光老化皮膚AGE堆積中起重要作用。我們的結果還提示，AGE?BSA在光老化細胞內堆積明顯高于正常成纖維細胞，由于一種物質在溶酶體內堆積常提示該物質降解減少［13］，故推測AGE?BSA在光老化成纖維細胞溶酶體內的降解很可能低于非光老化成纖維細胞。

為驗證推測，我們以AGE?BSA孵育細胞8 h后去除，細胞繼續培養24 h，采用ELISA檢測各組AGE濃度在這兩時點間的變化，發現光老化細胞AGE濃度下降程度顯著低于非光老化細胞AGE，表明AGE?BSA在光老化細胞內降解明顯低于非光老化細胞，揭示光老化抑制成纖維細胞對吞入胞內AGE的降解，進而促進AGE在光老化皮膚中的堆積。光老化通過什么機制抑制AGE在成纖維細胞內降解目前還不清楚。Grimm等［5］以純化組織蛋白酶D、B以及20S蛋白酶體等分別孵育AGE，發現20S蛋白酶體完全不能降解AGE，組織蛋白酶D、B能降解AGE，其中組織蛋白酶D降解活性顯著高于B。本研究發現，吞入成纖維細胞內的AGE?BSA主要位于溶酶體內，提示溶酶體蛋白酶很可能在胞內AGE降解中起主導作用。我們的前期研究還發現，溶酶體組織蛋白酶B、D及K在光老化皮膚及成纖維細胞中表達均降低［14］，提示光老化很可能通過降低組織蛋白酶B、D及K表達抑制吞入成纖維細胞內的AGE降解。何種蛋白酶在皮膚成纖維細胞降解胞內AGE中起關鍵作用，光老化是否通過抑制該酶表達和活性進而影響AGE胞內降解有待進一步研究。

參考文獻

［1］Gkogkolou P,B?hm M.Advanced glycation end products:key players in skin aging?［J］.Dermatoendocrinol,2012,4（3）:259 ?270.doi:10.4161/derm.22028.

［2］Farrar MD.Advanced glycation end products in skin ageing and photoageing:what are the implications for epidermal function?［J］.ExpDermatol,2016,25（12）:947?948.doi:10.1111/exd.13076.

［3］Nowotny K,Grune T.Degradation of oxidized and glycoxidized collagen:role of collagen cross?linking［J］.Arch Biochem Biophys,2014,542:56?64.doi:10.1016/j.abb.2013.12.007.

［4］Grimm S,Horlacher M,Catalgol B,et al.Cathepsins D and L reduce the toxicity of advanced glycation end products［J］.Free Radic Biol Med,2012,52（6）:1011 ?1023.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2011.12.021.

［5］Grimm S,Ernst L,Gr?tzinger N,et al.Cathepsin D is one of the major enzymes involved in intracellular degradation of AGE?modified proteins［J］.Free Radic Res,2010,44（9）:1013 ?1026.doi:10.3109/10715762.2010.495127.

［6］許慶芳,侯巍,鄭躍,等.MAPK信號通路調控長波紫外線誘導的皮膚成纖維細胞組織蛋白酶K表達［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（8）:543?547.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.08.003.

［7］侯巍,許慶芳,劉晨,等.組織蛋白酶B在急性光損傷皮膚成纖維細胞中的表達及意義［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（11）:776?779.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.011.003.

［8］Lamore SD,Wondrak GT.UVA causes dual inactivation of cathepsin B and L underlying lysosomal dysfunction in human dermal fibroblasts［J］.J Photochem Photobiol B,2013,123:1?12.doi:10.1016/j.jphotobiol.2013.03.007.

［9］Li W,Zhou BR,Hua LJ,et al.Differential miRNA profile on photoaged primary human fibroblasts irradiated with ultraviolet A［J］.Tumour Biol,2013,34（6）:3491?3500.doi:10.1007/s13277?013?0927?4.

［10］許新雅,許慶芳,鄭躍,等.晚期糖基化終末產物對UVA照射皮膚成纖維細胞組織蛋白酶D表達及其活性的影響［J］.中華皮膚科雜志,2016,49（8）:582?586.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.08.013.

［11］Pageon H,Zucchi H,Rousset F,et al.Skin aging by glycation:lessons from the reconstructed skin model［J］.Clin Chem Lab Med,2014,52（1）:169?174.doi:10.1515/cclm?2013?0091.

［12］Yoshinaga E,Kawada A,Ono K,et al.N（?）?（carboxymethyl）lysine modification of elastin alters its biological properties:implications for the accumulation of abnormal elastic fibers in actinic elastosis［J］.J Invest Dermatol,2012,132（2）:315 ?323.doi:10.1038/jid.2011.298.

［13］Li J,Cui X,Ma X,et al.rBTI reduced β?amyloid?induced toxicity by promoting autophagy?lysosomal degradation via DAF?16 inCaenorhabditis elegans［J］.Exp Gerontol,2017,89:78 ?86.doi:10.1016/j.exger.2017.01.018.

［14］許慶芳,侯巍,劉晨,等.UVA照射對皮膚成纖維細胞組織蛋白酶K表達的影響［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（9）:652?655.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2013.09.013.