SIRT1對肺炎鏈球菌感染肺上皮細胞誘導LL-37表達的調控機制

應 櫻

浙江省嘉興市第一醫院呼吸科，浙江嘉興 314000

目前，抗生素耐藥已經成為一個重大的公共衛生問題，臨床治療感染性疾病的新方向變為將內源性天然抗生素抗菌肽LL-37表達增加，促進宿主免疫防御功能的提升[1-3]。為了將有效的理論依據提供給臨床對抗生素的科學合理應用，對感染性疾病進行積極有效的治療，從而對患者預后進行切實有效的改善，本文研究SIRT1對肺炎鏈球菌感染肺上皮細胞誘導LL-37表達的調控機制進行了研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗設計時間為2016年11月～2017年10月，采用中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫提供的人肺腺癌細胞系A549（A549細胞）、人支氣管上皮細胞（BEAS-2B細胞），美國模式肺炎鏈球菌（SP）作為細胞菌株，培養物集存庫 （ATCC）為6303。美國GIBCO公司生產的RPMI1640培養基、杭州四季青生物工程材料有限公司生產的胎牛血清、美國OXOID公司生產的哥倫比亞血瓊脂基礎等，美國Forma公司生產的二級生物安全柜，美國Thermo公司生產的超凈工作臺、CO2培養箱等。

1.2 方法

對細胞進行重懸，在此過程中將不含雙抗RPMI1640培養液充分利用起來，以（3～4）×105/mL密度在6孔板中接種A549細胞，待細胞向30%～50%滿皿底面積生長時分為對照組、si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組、陰性對照 siRNA（siRNA-NC）組、lipo組五組。其中對照組不將其他試劑加入培養基；si-SIRT1序列①組將轉染si-SIRT1序列①加入培養基；si-SIRT1序列②組將轉染si-SIRT1序列②加入培養基；陰性對照siRNA（siRNA-NC）組將轉染不匹配人的任何基因的siRNA（轉染無意義siRNA）加入培養基，將其作為對照，以將本實驗受到siRNA及轉染操作的影響排除；lipo組將lipofectaminTM2000試劑加入培養基，以將本實驗受到脂質體的影響排除。上海吉馬公司設計合成SIRT1 siRNA序列，具體見表1。由于細胞轉染siRNA中涉及RNA，因此去酶處理實驗中應用EP管及槍頭等實驗器材，從而有效避免Rnase降解的現象。采用qRT-PCR對A549細胞的SIRT1沉默效果進行檢測，并采用Western Blot對A549細胞的SIRT1沉默效果進行檢測[4-10]。

表1 SIRT1 siRNA序列[4]

1.3 觀察指標

培養瓶或6孔板中的BEAS-2B及A549細胞向30%～50%左右滿皿底面積生長時分別進行3 d的細胞轉染處理，在此過程中嚴格依據組別，SIRT1激動劑（SRT1720）對細胞進行干預后，將新鮮無雙抗培養液加入其中孵育。將MOI：20的SP菌懸液加入到各孔中，對照組除外，進行6 h的感染后將感染終止。將PBS預處理細胞設定為對照組，將SPS感染設定為SP組，將SP感染+75 nmol/L si-SIRT1序列②轉染3 d設定為si-SIRT1+SP組，將SP感染+25 μmol/L的SRT1720預賦予1 d設定為SRT1720+SP組，將SP感染+25 μmol/L DMSO預孵育 1 d設定為 DMSO+SP組，各組均進行3次重復。采用LDH細胞毒性試驗對各組細胞活力進行檢測，采用qRT-PCR對BEAS-2B及A549細胞SIRT1及LL-37 mRNA表達進行檢測，采用ELISA對BEAS-2B及A549細胞上清液LL-37濃度進行檢測[11-18]。

1.4 統計學分析

采用SPSS21.0統計學軟件，qRT-PCR檢測A549細胞的SIRT1沉默效果、Western Blot檢測A549細胞的SIRT1沉默效果、五組對BEAS-2B及A549細胞毒性活力的影響、SIRT1對 SP誘導 BEAS-2B及A549細胞表達LL-37 mRNA的影響等計量資料用（±s）表示，采用 t檢驗，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測A549細胞的SIRT1沉默效果

si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1 mRNA均顯著低于對照組（P<0.05），而si-SIRT1序列②組的SIRT1 mRNA又顯著低于si-SIRT1序列①組（P<0.05），見表 2。

表2 qRT-PCR檢測A549細胞的SIRT1沉默效果（±s）

表2 qRT-PCR檢測A549細胞的SIRT1沉默效果（±s）

注：與si-SIRT1序列①組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05

組別 獨立試驗次數 SIRT1 mRNA對照組si-SIRT1序列①組si-SIRT1序列②組siRNA-NC組lipo組F值P 33333 1.05±0.11 0.70±0.12*0.15±0.04#*0.93±0.10 1.12±0.10 42.660<0.05

2.2 Western Blot檢測A549細胞的SIRT1沉默效果

si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1/β-actin均顯著低于對照組（P<0.05），lipo組的SIRT1/β-actin顯著高于對照組（P<0.05），但 siRNA-NC組和對照組的SIRT1/β-actin之間的差異不顯著 （P>0.05），si-SIRT1 序 列 ① 組 、si-SIRT1 序 列 ② 組 的SIRT1/β-actin 之間的差異也不顯著（P>0.05），見表3。

2.3 五組對BEAS-2B及A549細胞毒性活力的影響比較

SP組、si-SIRT1+SP組的BEAS-2B及A549細胞毒性均顯著高于對照組（P<0.05），而si-SIRT1+SP組的BEAS-2B及A549細胞毒性又均顯著高于SP組（P<0.05），見表 4。

表3 Western Blot檢測A549細胞的SIRT1沉默效果（±s）

表3 Western Blot檢測A549細胞的SIRT1沉默效果（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別 獨立試驗次數 SIRT1/β-actin對照組si-SIRT1序列①組si-SIRT1序列②組siRNA-NC組lipo組F值P 33333 0.23±0.01 0.14±0.01*0.11±0.01*0.20±0.01 0.40±0.03*72.530<0.05

表4 五組對BEAS-2B及A549細胞毒性活力的影響比較（±s，%）

表4 五組對BEAS-2B及A549細胞毒性活力的影響比較（±s，%）

注：與SP組比較，*P<0.05

組別 獨立試驗次數 BEAS-2B細胞毒性 A549細胞毒性對照組SP組si-SIRT1+SP組SRT1720+SP組DMSO+SP組F值P 33333 0.35±0.07*7.74±1.65 19.60±1.86*8.51±0.80 8.34±1.51 98.261<0.05 0.20±0.03*4.42±0.40 15.26±1.63*4.85±0.25 4.67±0.38 152.920<0.05

2.4 SIRT1對SP誘導BEAS-2B及A549細胞表達LL-37 mRNA的影響

2.4.1 SIRT1對SP誘導BEAS-2B細胞表達LL-37mRNA的影響 BEAS-2B細胞方面，si-SIRT1+SP組的SIRT1 mRNA 顯著低于 SP 組（P<0.05），LL-37 mRNA顯著高于SP組（P<0.05）；SRT1720+SP組的SIRT1 mRNA顯著高于SP組（P<0.05），LL-37 mRNA顯著低于SP 組（P<0.05）。 SP 組、SRT1720+SP 組、DMSO+SP 組的 SIRT1 mRNA均顯著高于對照組 （P<0.05），si-SIRT1+SP組的SIRT1 mRNA顯著低于對照組 （P<0.05）；SP 組、si-SIRT1+SP 組的 LL-37 mRNA均顯著高于對照組 （P<0.05），SRT1720+SP組的LL-37 mRNA顯著低于對照組（P<0.05），但DMSO+SP組和對照組的LL-37 mRNA之間的差異不顯著（P>0.05），見表5。

表5 SIRT1對SP誘導BEAS-2B細胞表達LL-37mRNA的影響（±s）

表5 SIRT1對SP誘導BEAS-2B細胞表達LL-37mRNA的影響（±s）

注：與SP組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05

組別 獨立試驗次數 SIRT1 mRNA LL-37 mRNA對照組SP組si-SIRT1+SP組SRT1720+SP組DMSO+SP組F值P 55555 1.04±0.11 3.05±0.42*0.20±0.05#*8.54±0.55#*2.95±0.32*420.445<0.05 1.07±0.17 3.88±0.35*12.78±2.32#*0.43±0.04#*2.87±0.54 105.930<0.05

2.4.2 SIRT1對SP誘導A549細胞表達LL-37 mR-

NA的影響 A549細胞方面，si-SIRT1+SP組的SIRT1mRNA顯著低于SP組（P<0.05），LL-37 mRNA顯著高于SP 組（P<0.05）；SRT1720+SP 組的SIRT1 mRNA 顯著高于 SP組（P<0.05），LL-37 mRNA 顯著低于 SP組（P<0.05）。SP組、SRT1720+SP組、DMSO+SP組的 SIRT1 mRNA均顯著高于對照組 （P<0.05），si-SIRT1+SP組的 SIRT1 mRNA 顯著低于對照組（P<0.05）；SP組、si-SIRT1+SP組的LL-37 mRNA均顯著高于對照組 （P<0.05），SRT1720+SP組的LL-37 mRNA顯著低于對照組（P<0.05），但DMSO+SP組和對照組的LL-37 mRNA之間差異不顯著（P>0.05），見表6。

表6 SIRT1對SP誘導A549細胞表達LL-37 mRNA的影響（±s）

表6 SIRT1對SP誘導A549細胞表達LL-37 mRNA的影響（±s）

注：與SP組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05

組別 獨立試驗次數 SIRT1 mRNA LL-37 mRNA對照組SP組si-SIRT1+SP組SRT1720+SP組DMSO+SP組F值P 55555 1.04±0.11 2.65±0.45*0.13±0.02#*5.54±0.44#*2.35±0.30*198.556<0.05 1.05±0.15 2.30±0.30*5.18±1.00#*0.47±0.08#*1.65±0.31 67.530<0.05

3 討論

SIRT1的生物學作用廣泛，能夠對NAD+依賴性蛋白進行催化，促進其乙酰化的發生，在轉錄、代謝過程中作為調節因子發揮極為重要的作用[19-21]。LL-37受外源性微生物成分和內源性信號分子刺激誘導產生，其表達調控機制復雜多樣，彼此存在交叉對話，且存在細胞種類和微環境刺激特異性。在細胞非應激狀態時，l，25-二羥基維生素 D3[1，25-dihydroxyvitamin D3，l，25（OH）2D3]，在多種調控 LL-37 表達因子中起樞紐作用，多種物質可經維生素D3依賴機制放大其誘導效應。細胞因子可通過維生素D3介導或其他作用機制放大其誘導LL-37表達效應。在外界干擾觸發內質網應激時，NF-κB．C/EBPa通路在表達調控中起關鍵作用。細胞分化狀態亦參與LL-37的表達調控。最近應用無標記質譜定量分析的生物信息學軟件又發現TR/RXR激活、類花生酸信號和類固醇生物合成這三種新型信號通路參與LL-37的表達調節。相關醫學研究表明[22-25]，SP對BEAS-2B細胞活性造成損傷的方式為MOI與感染時間依賴性，SP感染BEAS-2B及A549細胞能夠對LL-37表達進行誘導，在機體免疫防御反應中參與。與A549細胞相比，BEAS-2B細胞SP（MOI20）感染6 h及未感染狀態下均具有顯著較高的LL-37蛋白表達，以此認為LL-37表達可能具有細胞特異性。SP感染時，在BEAS-2B及A549細胞LL-37表達中，SIRT1均發揮著負性調節作用。

本研究結果表明，si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1 mRNA均顯著低于對照組 （P<0.05），而si-SIRT1序列②組的SIRT1 mRNA又顯著低于si-SIRT1序列①組 （P<0.05）；si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1/β-actin均顯著低于對照組（P<0.05），lipo 組的 SIRT1/β-actin 顯著高于對照組（P<0.05），但 siRNA-NC 組和對照組的 SIRT1/βactin之間的差異不顯著 （P>0.05），si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1/β-actin之間的差異也不顯著 （P>0.05）；SP組、si-SIRT1+SP組的 BEAS-2B及A549細胞毒性均顯著高于對照組（P<0.05），而si-SIRT1+SP組的BEAS-2B及A549細胞毒性又均顯著高于SP組 （P<0.05）；BEAS-2B細胞及A549細胞方面，si-SIRT1+SP組的SIRT1 mRNA顯著低于SP組（P<0.05），LL-37 mRNA 顯著高于 SP 組（P<0.05）；SRT1720+SP組的SIRT1 mRNA顯著高于SP組 （P<0.05），LL-37 mRNA 顯著低于 SP 組（P<0.05）。SP 組、SRT1720+SP組、DMSO+SP組的SIRT1 mRNA均顯著高于對照組（P<0.05），si-SIRT1+SP組的SIRT1 mRNA顯著低于對照組 （P<0.05）；SP組、si-SIRT1+SP組的LL-37 mRNA均顯著高于對照組（P<0.05），SRT1720+SP組的LL-37 mRNA顯著低于對照組 （P<0.05），但DMSO+SP組和對照組的LL-37 mRNA之間的差異不顯著（P>0.05），和上述相關醫學研究結果一致。

總之，SIRT1對肺炎鏈球菌感染肺上皮細胞誘導LL-37表達起負性調節作用，值得臨床充分重視。

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