探討半枝蓮醇提物對小鼠細胞色素P450酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響

杜曉翔 陳必成

溫州醫科大學附屬第一醫院藥學部，浙江溫州 325000

半枝蓮是我國傳統中草藥之一，屬唇形科黃芩屬的干燥全草，味辛、平。其化學成分主要包括黃酮類、二萜類、生物堿以及多糖等，具有清熱解毒、抵抗炎癥、增強免疫力等功效。半枝蓮主要成分黃酮類化合物具有治療心血管疾病的作用，可以清除人體內產生的自由基，同時抑制細胞凋亡，延緩衰老[1-5]。我國曾有學者研究發現，黃酮類化合物具有抗腫瘤和治療癌癥的作用，可用于治療胃癌、直腸癌、肺癌、淋巴癌等。細胞色素P450家族為人體內一類重要物質，主要參與內源性物質及外源性物質（藥物、環境化合物等）的代謝過程，主要分布于內質網和線粒體內膜上[6-8]。研究表明，植物藥物中的活性成分可以影響細胞色素P450酶的活性，從而調控體內藥物代謝過程。谷胱甘肽S-轉移酶是藥物代謝反應中十分重要的一種藥物代謝轉移酶，其作用是催化外源物質的代謝，促進內源性化合物例如膽紅素、短鏈脂肪酸等的分解。因此，本研究選取傳統中草藥半枝蓮作為研究對象，選取40只SD小鼠隨機分為試驗組（低劑量組、中劑量組、高劑量組）和對照組，每組各10只。試驗組使用不同劑量半枝蓮醇提物對小鼠進行灌胃，對照組使用等量生理鹽水，連續灌胃5 d，第6天處死小鼠，采集肝臟組織，觀察半枝蓮醇提物對于小鼠細胞色素P450和谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響。通過本次研究，我們期望可以觀察到半枝蓮提取物對于藥物代謝酶的影響，深入了解其藥物作用機制，為今后臨床用藥提供一定的參考作用。

1 資料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與分組 40只成年雄性SD小鼠，體重均為200 g，所有大鼠均購自上海杰思捷實驗動物有限公司。將40只小鼠隨機分為4組，分別為對照組（10只）和試驗組（30只）。試驗組根據半枝蓮醇提物灌胃劑量設立低劑量組（10只）、中劑量組（10只）和高劑量組（10只）。

1.1.2 試驗器材和藥品 旋轉蒸發儀、循環水真空泵、電加熱套、超速離心機、漩渦震蕩儀、勻漿機、電子分析天平、恒溫水浴搖床、酶標儀、紫外可見光分度計等。

半枝蓮購自亳州百川藥業，咪達唑侖、氯唑沙宗購自Sigma公司，谷胱甘肽S-轉移酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所，蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

制備半枝蓮醇提物，將半枝蓮粉碎準確稱量后加入10倍體積乙醇，靜置1 h，提取半枝蓮活性物質后濃縮，真空干燥回收干燥產物，準確稱量其產物含量，得到半枝蓮醇提物。試驗組分別按照每天1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg劑量進行灌胃，分別為低劑量組（1 g/kg）、中劑量組（5 g/kg）、高劑量組（10 g/kg）。 對照組小鼠給予等量生理鹽水灌胃。小鼠室溫飼養，自由飲水，需在試驗環境下適應5 d及以上，每日早晨7點進行灌胃，保證正常飲食，第5天給藥后禁食過夜。連續給藥5 d，第6天采用頸椎脫臼法處死小鼠，提取肝臟組織，使用咪達唑侖、氯唑沙宗作為藥物探針進行體外代謝，研究半枝蓮醇提物對小鼠細胞色素P450酶活性的影響，利用蛋白濃度測定試劑盒檢測細胞色素P450酶含量，利用谷胱甘肽S-轉移酶試劑盒測定谷胱甘肽S-轉移酶活性。

1.3 觀察指標

觀察并記錄細胞色素P450酶含量，計算方法和公式根據Omura and Sato關于細胞色素P450含量的測定，為細胞色素 P450（nmol·mg/protein）=[（A450-A490）×1000]/（91×被測樣品蛋白濃度）。 根據體外代謝藥的產率計算酶活性。谷胱甘肽S-轉移酶活性根據試劑盒說明書進行測定。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用 t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 半枝蓮醇提物對小鼠細胞色素P450含量及活性的影響

與對照組相比，試驗組低劑量組細胞色素P450含量和活性不存在差異（P>0.05），而中劑量組和高劑量組小鼠細胞色素P450含量和活性出現顯著下降的趨勢（P<0.05）。 見表 1。

表1 不同組別小鼠細胞色素P450含量和活性情況比較（±s）

表1 不同組別小鼠細胞色素P450含量和活性情況比較（±s）

組別 n 細胞色素P450含量（nmol/mg protein）細胞色素P450活性（nmol/min/mg protein）對照組試驗組低劑量組中劑量組高劑量組100.79±0.154.32±1.66 10 10 10 0.72±0.11 0.61±0.13 0.59±0.11 4.06±1.41 3.78±1.75 2.45±1.26

2.2 半枝蓮醇提物對小鼠谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響

與對照組相比，試驗組小鼠谷胱甘肽S-轉移酶活性無顯著性差異（P>0.05），但中劑量組和高劑量組活性出現下降趨勢。見表2。

表2 不同組別小鼠谷胱甘肽S-轉移酶活性的情況比較（x±s）

3 討論

中國地域廣闊，物種豐富，是中草藥的發源地，據統計目前中國大約存在有12 000種的藥用植物，在中草藥研究方面，我國也擁有著豐富的經驗，結合現代醫學技術，中草藥在臨床上的應用越來越廣泛，也得到了廣大患者和醫師的認可。半枝蓮作為我國傳統中草藥之一，是馬唇形科黃芩屬多年生草本植物。全草均可入藥，性寒味酸，富含多種維生素、微量元素及氨基酸等成分，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛、涼血解毒，清熱利濕、抗癌等功效[9-13]。細胞色素P450和谷胱甘肽S-轉移酶均與體內藥物代謝過程有關，因此,本研究通過給予小鼠不同劑量半枝蓮醇提物，觀察其對小鼠細胞色素P450酶活性和谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響，從而為今后半枝蓮在臨床上的應用提供一定的參考作用。

在本研究中，通過比較對照組小鼠和不同劑量半枝蓮醇提物組細胞色素P450酶含量和酶活性的影響，結果顯示：與對照組相比，試驗組低劑量組細胞色素P450含量和活性不存在差異（P>0.05），而中劑量組和高劑量組小鼠細胞色素P450含量和活性出現顯著下降的趨勢（P<0.05）。表明半枝蓮醇提物可以抑制小鼠細胞色素P450酶活性，也說明半枝蓮提取物可以在一定程度上影響特定藥物代謝酶活性，并且半枝蓮濃度越高，抑制作用越大。此結果也與朱慧賢等[14]的研究結果一致。細胞色素P450酶可以調節肝臟對內源性物質和外源性物質的代謝過程，其出現抑制后可以誘導全身藥物代謝過程異?，F象，最終導致嚴重的毒性反應，危害患者的生命安全[15-18]。高濃度的半枝蓮可以極大程度地抑制細胞色素P450酶的活性，促進前致癌物及毒性物質的活化過程，有研究表明，藥物代謝性相互作用引起的藥物不良反應有超過95%均由細胞色素P450酶引起。因此在臨床使用時需要充分考慮其不良影響。本研究還分析了半枝蓮醇提物對谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響，結果發現：與對照組相比，試驗組小鼠谷胱甘肽S-轉移酶活性沒有出現顯著差異（P>0.05），但中劑量組和高劑量組活性出現了下降的趨勢。該結果說明半枝蓮可以通過影響藥物代謝酶谷胱甘肽S-轉移酶活性來影響藥物代謝過程。谷胱甘肽S-轉移酶可以降低外源性化合物的毒性，具體作用機制是催化葡萄糖醛酸苷形成，加速葡萄糖醛酸苷和谷胱甘肽及其代謝產物結合，形成水溶性代謝產物[19]。有文獻報道，谷胱甘肽S-轉移酶還可以保護蛋白質、核酸等遺傳物質成分，降低癌癥的發病率[20]。眾所周知，致癌物是間接致癌物，其自身無致癌特性，但是在體內經過酶的活化作用，最終轉變成為親電子性終致癌物。谷胱甘肽-S-轉移酶可以催化親電子化合物和內源性谷胱甘肽結合，從而保護遺傳物質的穩定，降低癌癥的發病率。另一方面，對于已經代謝形成的致癌物質，在谷胱甘肽-S-轉移酶的作用下，也可以轉變形成可被機體代謝排出的水溶性物質，抑制致癌物質對機體的損傷作用。而本研究中發現了半枝蓮醇提物會抑制該酶的活性，改變藥物代謝過程，說明半枝蓮醇提物會阻止需要谷胱甘肽-S-轉移酶參與活化的物質的形成過程。

綜上所述，半枝蓮醇提物可以對小鼠細胞色素P450酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性起到一定的抑制作用，且濃度越高，抑制程度越大，提示臨床使用半枝蓮醇提物時需要考慮藥物之間的相互作用，避免產生藥物毒性。

[參考文獻]

[1]張梅，韓松洋，葛圓圓，等.半枝蓮提取物對人肺癌A549細胞的凋亡作用及其對凋亡相關基因表達的影響[J].陜西中醫，2016，37（6）：756-758.

[2]周凌凌，胡筱希，丁霞.半枝蓮提取物抗乙肝病毒體外實驗研究[J].中藥材，2015，38（5）：1042-1045.

[3]陳志成，史仁杰.半枝蓮提取物對人大腸癌細胞系凋亡的影響[J].江蘇醫藥，2013，39（2）：141-144.

[4]石銳，郭素青，劉珊，等.半枝蓮對白血病K562細胞VEGF表達的影響[J].中國實驗血液學雜志，2016，24（5）：1339-1342.

[5]陳紅梅，謝翎.響應面法優化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析[J].食品科學， 2016，37（2）：45-50.

[6]王桂玲，房建強，邊書芹，等.半枝蓮中總生物堿的提取及抑菌作用的初步研究[J].中成藥，2013，35（6）：1315-1319.

[7]葉華，吳瓊，郭蒙，等.半枝蓮多糖對C26荷瘤小鼠血清Th1/Th2亞群細胞因子的影響[J].癌癥進展，2013，11（1）：68-81.

[8]范悅，吳曉光，趙泓翔，等.半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起的大鼠皮層星形膠質細胞NOS、HSP70及apoE異常表達的影響[J].中國病理生理雜志，2014，30（2）：359-379.

[9]趙泓翔，郭可，崔亞迪，等.半枝蓮黃酮對復合Aβ_（25-35）引起線粒體膜 Bcl-2、Bax、Bcl-xL 及 Bak 異常的干預作用[J]. 中國病理生理雜志，2014，30（12）：2262-2266.

[10]逄亞楠，國錦，閆輝，等.半枝蓮與白花蛇舌草及其藥對石油醚部位成分分析及其抗子宮內膜癌細胞活性研究[J].中藥材，2016，39（4）：789-794.

[11]梁彩霞，曹英夕，張東，等.半枝蓮中1個新克羅烷二萜化合物[J].中草藥，2015，46（19）：2843-2845.

[12]孫麗紅，王海穎.參靈合劑對原發性肝癌小鼠抗腫瘤免疫反應的實驗研究[J].中國中西醫結合消化雜志，2015，23（5）：311-314.

[13]郭可，吳曉光，繆紅，等.半枝蓮黃酮對復合Aβ所致大鼠皮層細胞凋亡抑制作用及線粒體凋亡通路的調節機制[J].中國醫院藥學雜志，2015，35（22）：1994-1999.

[14]朱慧賢，譙鳳英，胡思源，等.半枝蓮總黃酮膠囊治療急性咽炎肺胃實熱證的Ⅱ期臨床研究[J].現代藥物與臨床，2017，32（7）：1259-1263.

[15]劉冬，宋豎旗，尹學來，等.中醫藥治療膀胱癌用藥規律分析[J].中醫學報， 2017， 32（1）：4-8.

[16]汪維佳，李照，華育暉，等.半枝蓮不同極性提取物對人胚腎細胞體外活性的影響[J].實用腫瘤雜志，2016，31（3）：228-231.

[17]Kan X，Zhang W，You R， et al.Scutellaria barbata D.Don extract inhibits the tumor growth through down-regulating of Treg cells and manipulating Th1/Th17 immune response in hepatoma H22-bearing mice[J].Bmc Complementary&Alternative Medicine，2017，17（1）：41.

[18]Wu T，Wang Q，Jiang C，et al.Neo-clerodane diterpenoids from Scutellaria barbata with activity against Epstein-Barr virus lytic replication[J].Journal of Natural Products，2015，78（3）：500-509.

[19]Dong Y.H2O2electrochemical sensor based on scutellaria barbata extract biosynthesized of gold nanoparticles[J].International Journal of Electrochemical Science， 2016，11（12）：10919-10927.

[20]Li R，Song W，Qiao X，et al.Chemical profiling of Scutellaria barbata by ultra high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupoleorbitrap mass spectrometry[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2015，24（10）：635-646.