鉀肥對煙草青枯病的防控效果及其根際微生物群落的影響

摘要[目的]探討施用鉀肥對煙草青枯病的防控效果及其根際微生物群落的影響。[方法]通過田間試驗研究施用不同量鉀肥對煙草青枯病的防控效果及其對根際微生物群落多樣性和細菌分類的影響。[結果]田間施用150 kg/hm2 鉀肥時，煙草青枯病病情指數最低，土壤根際中青枯病原菌數量最少，為5.63 log CFU/g 干土，而無鉀肥處理的效果最差。施鉀肥提高了煙草生物量、鉀含量和總酚含量。施用150 kg/hm2 鉀肥能顯著提高煙草根際微生物的多樣性，增加益生菌Arthrobacter的相對豐度，降低了致病菌Ralstonia的相對豐度。[結論]施用適量鉀肥可有效地防控煙草青枯病，提高根際微生物的多樣性和有益菌的相對豐度，降低致病菌的相對含量。

關鍵詞 煙草青枯病；鉀肥；病情指數；根際微生物群落

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0125-03

Abstract[Objective]To explore the effect of application potassium fertilizer on tobacco bacterial wilt and its effect on rhizosphere microbial communities.[Method]The field experiment was conducted to study effects of different amounts of K fertilizer on tobacco bacterial wilt and its rhizosphere microbial communities.[Result]When the amount of K was 150 kg/hm2 in the field trial， the disease index of tobacco bacterial wilt was the lowest， and the number of Rhizoctonia in soil rhizosphere was the least which was 5.63 log CFU/g of dry soil， but the no K fertilizer addition treatment was the worst. The application of K fertilizer could increase the biomass， K concentration and total phenol content of tobacco. The application of 150 kg/hm2 K fertilizer could significantly increase the diversity of rhizosphere microorganisms， increase the relative abundance of probiotic Arthrobacter and reduce the relative abundance of Ralstonia.[Conclusion]The application of appropriate K fertilizer can effectively control tobacco bacterial wilt in field experiment， improve the diversity of rhizosphere microorganisms and the relative abundance of beneficial bacteria， reduce the relative content of Ralstonia.

Key words Tobacco bacterial wilt；Potassium fertilizer；Disease index；Rhizosphere microbial communities

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經濟作物，且種植面積和產量均居世界第一位[1-2]。貴州省自然生態條件優越，適宜煙草的種植[2-3]。隨著貴州省煙草種植業的發展，其地區氣溫高和空氣濕度大的環境原因，以及煙草長期連作等因素，容易造成煙草病害的大面積暴發，特別是煙草的土傳病害[3-4]。煙草青枯病是一種典型的土傳維管束植物病害，其病原菌為茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum），煙草發病時多為一側萎焉，葉片支脈間產生黑色的斑紋，其根系變黑腐爛，最后整株煙草葉片枯萎[1，5]。防治該病害一直是煙草種植上的難點，目前使用化學農藥雖然能部分控制病害的發生和傳播，但過量使用農藥不但造成煙葉品質的下降，還容易造成環境污染[1，4]。因此，利用簡單的施肥策略是一種環保的防治病害措施，也是農業科學家研究的熱點，成為防治煙草土傳青枯病害的重要途徑之一。

施鉀能提高植物對病害的抗性在國內外已有較多報道[6-8]。如在田間施鉀肥，能有效抑制玉米莖腐病原菌在植物體內的擴展和繁殖，進而抑制病害的發生[6]；另外，噴施鉀肥可以提高油菜葉片酚類物質的含量和多酚氧化酶的活性，從而降低油菜黑斑病的發病率[7]。施鉀能提高植物對病害的抗性，主要功能在于鉀參與植物形態學調節機制，能使植物形成厚實的細胞壁，提高木質化程度，使莖稈和葉片變厚；調控植物生長代謝機制，在鉀的酶促作用下完成糖類、木質素、淀粉等物質的合成；鉀還能提高酚類物質的合成速率，從而減少病原菌的入侵[6-9]。目前研究鉀對植物的抗性機理主要在地上部分，而地下部根系是植物吸收營養和水分的主要器官，接觸土壤微生物群落的重要區域。施鉀對煙草根際微生物多樣性和細菌菌落組成的影響，以及對煙草青枯病的防治效果，目前鮮見報道。筆者通過田間試驗，研究不同鉀肥水平對煙草青枯病的防治效果，并探索其對根際微生物多樣性和細菌群落組成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙草品種為青枯病敏感品種DJY。煙草青枯病原菌為田間自然發病接種，植株發病后進行病原菌分離，鑒定病原菌為Ralstonia solanacearum。

1.2 試驗地概況

試驗在貴州省畢節地區煙草種植試驗基地進行，土壤基本理化性狀：pH 5.6，有機質11.8 g/kg，速效氮132.5 mg/kg，速效磷12.6 mg/kg，速效鉀105.3 mg/kg。

1.3 試驗方法

煙草移栽時間為2016年4月18日，煙草青枯病調查時間為7月28日。隨機區組設計，試驗為4個處理，分別為K0無鉀肥；K75施用75 kg/hm2 鉀肥；K150 施用150 kg/hm2 鉀肥；K225施用225 kg/hm2 鉀肥，鉀肥為K2O。氮和磷的施用量：氮肥90 kg/hm2，磷肥P2O5 75 kg/hm2。每個處理小區面積為64 m2，設置4個重復，田間管理參照當地煙草栽培生產技術。

進行煙草青枯病調查時，按照如下病害分級：0級，全葉無病斑；1級，莖部偶有褪色病斑，或黑色條斑一側有少數葉片萎蔫；2級，莖部有黑色條斑，但尚未達到植株頂部，或發病一側有50%以上葉片萎蔫；3級，莖部有黑色條斑達到煙草植株頂部，或發病一側有2/3的葉片萎蔫；4級，植株基本枯死[10]。病情指數的計算方法：[（∑各級數×該級株數）/（最高等級數×調查總株數）]×100。每個處理5個點取樣調查，每個點10株，共調查50株，逐株記載病害分級。調查完葉片后隨即采集葉片，取回實驗室進行檢測，主要測定指標包括整株生物量、鉀含量、總酚含量，每個指標測定4次。

在調查完煙草青枯病后，隨即采集根際土樣品，每個處理隨機選取5株進行根際土收集，樣品一部分保存于4 ℃冰箱用于測定土壤中青枯病病原菌的數量[1]，其余保存于-80 ℃冰箱用于高通量測序。土壤微生物采用高通量測序技術，豐富度（Ace和Chao 1）和香農指數（Shannon diversity）主要采用mothur軟件分析[11]。

1.4 測定項目與方法

收獲的煙草樣品先在105 ℃下殺青30 min，然后于75 ℃下烘干至恒重后稱重；將樣品粉碎，利用H2SO4-H2O2進行消煮，用火焰光度計法測定植株的鉀濃度；總酚含量的測定：取1 g樣品，加入5 mL 1% HCl的甲醇溶液，提取24 h，取0.l mL提取液稀釋，定容至5 mL，搖勻，用分光光度計測定280 nm處OD值即為總酚含量[6]。SMSA培養基用于根際土壤中煙草青枯病原菌數量的測定[12]。

1.5 數據分析

采用Excel 2010 對原始數據進行處理，利用SAS 9.0對數據進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同鉀肥施用量對煙草青枯病病情指數和根際土中病原菌含量的影響

從圖1可以看出，施鉀肥均能顯著降低煙草青枯病的發生。當施鉀量為K150（150 kg/hm2）時，病情指數最低，比K75（75 kg/hm2）和K225（225 kg/hm2）處理分別降低了23%和4%，無鉀肥處理K0（0 kg/hm2 ）的病情指數最高。煙草根際土中的青枯病原菌，K150處理的病原菌含量最少，比K0和K75處理分別降低了30%和14%，K0處理根際土中青枯病原菌含量最高。說明施鉀能有效地降低煙草青枯病的發生，同時減少了病原菌在根際土壤中的含量，但并不是鉀肥施用越多，其發病程度越低。

2.2 不同鉀肥施用量對煙草生物量、鉀含量和總酚含量的影響

由表1可知，施鉀顯著提高了煙草生物量、鉀含量和總酚含量。在生物量方面，K225處理的煙草生物量最高，比K0和K75處理分別提高了100%和27%，雖然K150處理的施鉀肥量不是最高，但與K225處理相比無顯著差異，僅降低了3%。說明鉀肥不是施用量越多，煙草生物量越高，而是需要按照煙草的生長所需來提供適宜的鉀肥。在鉀含量方面，施用鉀肥越多，葉片的鉀含量越高。其中，K225處理鉀含量最高，比K0、K75和K150處理分別提高了37%、28%和12%。在總酚方面，K150處理的總酚含量最高，K75和K225處理次之，K0處理最低。

2.3 不同鉀肥施用量對煙草根際微生物多樣性的影響

從表2可以看出，施鉀提高了煙草根際微生物的多樣性。在Chao 1指標上，K150處理最高，比K0和K75處理分別提高了32%和19%，雖然K225處理施鉀量最高，但Chao 1 指數比K150處理下降了5%。Ace和Shannon指標有相同的趨勢，K150處理煙草葉片的Ace比K0和K75處理分別提高了21%和16%， 而K225處理比K150處理降低了6%。說明施用鉀肥能增加煙草根際土壤中的微生物多樣性，但并不是施用鉀肥越多，其微生物多樣性指數越高。

2.4 不同鉀肥施用量下根際細菌在屬分類水平上的分析

從表3可以看出，相對豐度最高的屬是Streptomyces，在各鉀水平中，分別占總細菌種群的6.43%（K0）、7.53%（K75）、11.33%（K150）和10.42%（K225）。其次是Arthrobacter，在K150處理的相對豐度為8.93%，高于K0處理的4.80%、K75處理的6.39%和K225處理的8.03%。同時，K150處理能顯著降低病原菌Ralstonia的相對豐度，K150處理所占總細菌數量的比例為0.73%，低于K0處理的1.32%、K75處理的1.09%和K225處理的1.13%，表明施鉀肥能有效降低土壤中煙草青枯病原菌Ralstonia的豐富度，同時對細菌在屬分類水平上有影響。

3 結論與討論

研究表明，在田間施用鉀肥對煙草青枯病有一定的防治效果。其中施鉀肥量為150 kg/hm2時煙草青枯病的發病程度最低，病原菌在根際土壤中的含量最少。相對于其他鉀肥處理，K150處理的煙草青枯病發病最輕，主要是由于施鉀增加了煙草的生物量，提高了與抗病相關的總酚含量以及葉片的鉀含量。同時，適當的鉀肥用量，對增加煙草根際土壤微生物的多樣性和益生菌有促進作用，減少了青枯病原菌在土壤中的相對豐度。

鉀能提高植物對抗逆境脅迫的能力和調節植物病害發生的功能[6-7，13]。當植物受到病原物侵染時，可通過調節自身的酚類代謝來抵御病原菌的入侵，從而提高植物的抗病性[14]。研究發現，噴施鉀肥能提高小麥葉片中酚類物質含量，同時增強了小麥對白粉病的抵抗能力[15]；施鉀提高了棉花棉酚含量，而棉酚含量與黃萎病的發生呈負相關[16]。該研究發現相似的結果，施鉀肥能顯著提高植株中的總酚含量，而當施鉀量為150 kg/hm2時，總酚含量最高，其煙草青枯病發病程度最低，說明適當施用鉀肥可通過調節煙草的總酚含量來提高作物的抗病性。同時，施鉀增加了植株的鉀含量，使植物的細胞壁增厚，從而抵御病原菌的入侵[7-8，13]，該研究發現施鉀肥能顯著提高煙草葉片的鉀含量，植株鉀含量隨鉀肥用量的提高而升高。但鉀肥用量并不是越高越好，而在鉀肥用量為150 kg/hm2時，其發病嚴重度最低。因此，在農業措施上防控煙草青枯病的發生，在選擇鉀肥用量時，依據植物對養分的需求，達到植株生物量和抵抗病害的最大化利益。

施鉀肥不僅能提高作物的產量和品質，還能改變土壤微生物的數量和種類，很多土傳病害的發生與根際微生物區系相關[10，17]。研究發現，調控根際中的微生物群落能有效減少病原微生物的數量，從而減少病害的發生[17-18]。賈志紅等[19]研究發現，施鉀提高了蕎麥根際土壤中細菌和放線菌的數量。該試驗發現，通過施用鉀肥提高了根際土壤中的微生物多樣性，特別是在鉀肥用量為150 kg/hm2時其多樣性指數最高。研究發現，Actinobacteria的相對豐度和煙草青枯病病情指數呈負相關[10]，且發現Arthrobacter屬中的一些細菌對青枯病病原菌具有拮抗能力[20]。通過細菌多樣性的分類可知，施鉀提高了Actinobacteria的相對豐度，其在鉀肥用量為150 kg/hm2時豐度比其他3個處理的相對豐度高。這可能是富集了土壤中的益生菌，從而能有效地防控煙草青枯病害的發生。因此，提高了煙草根際微生物多樣性，對應的病原菌豐度相對降低，從而獲得了健康的根際環境，有利于病害的防控。同時，施鉀提高作物對病害的抗性機制，鉀對防治煙草病害的抗性機理有待深入探討。

研究表明，當鉀肥施用量為150 kg/hm2時，能有效地降低煙草青枯病的發病程度，其根際病原菌數量顯著低于其他處理；同時提高了植株的總酚含量；也增加了根際微生物的多樣性和益生菌Arthrobacter的豐度，降低病原菌Ralstonia的相對豐度。適宜的鉀肥用量在農業上是一種簡單可行的防治煙草青枯病發生的策略。

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