過氧化氫酶2不參與調控擬南芥根部對鎘脅迫的耐受性

賈騏駿

摘要[目的]探討過氧化氫酶（CAT2）在擬南芥根部響應鎘脅迫過程中對主根生長、活性氧積累以及生長素信號的影響。[方法]在1/2 MS固體培養基中加入不同濃度的鎘處理擬南芥Col-0和CAT功能缺失突變體cat2幼苗。[結果]研究發現鎘脅迫會抑制主根的根長，而cat2的根長的抑制率與Col-0并無明顯差異。鎘處理后Col-0和cat2根中CAT活性也不會發生顯著變化。進一步比較Col-0和cat2根在鎘脅迫下的活性氧的積累，兩者活性氧增長率大致相同。最后檢測DR5：：N7-VENUS和cat2 DR5：：N7-VENUS根中生長素的信號表達，發現鎘脅迫對Col-0和cat2根中生長素的抑制率也沒有差異。[結論]CAT2不參與調控擬南芥根部對鎘脅迫的耐受性。

關鍵詞 擬南芥；鎘脅迫；過氧化氫酶；活性氧；生長素

中圖分類號 Q945.78 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0001-04

Abstract[Objective]Impact of catalase was discussed in the article based on the result of primary root length， reactive oxygen species accumulation and auxin signal in the primary root of Arabidopsis thliana responsive experiment under cadmium stress.[Method]Different concentrations of cadmium were added to 1/2 MS solid medium to treat Arabidopsis Col0 and CAT2 lossoffunction mutant cat2 seedlings.[Result]The study found that cadmium stress inhibited the root length of the main root， but the inhibition rate of cat2 root length was not significantly different from that of Col0.However， the root length results between cat2 and Col0 were no obvious differences. A similar conclusion also could be derived from the CAT activity in primary root after the cadmium stress treatment. Further comparing the accumulation of active oxygen in the roots of Col0 and cat2 under the cadmium stress， the growth rate of their active oxygen is roughly the same. Finally， the signal expression of auxin in Col0 DR5：：N7VENUS and cat2 DR5：：N7VENUS roots was detected. It was found that there was no difference in the inhibition rate of auxin in Col0 and cat2 roots by cadmium stress.[Conclusion]CAT2 is not involved in the regulation of tolerance to cadmium stress in Arabidopsis roots.

Key words Arabidopsis thaliana；Cadmium stress；Catalase； Reactive oxygen；Auxin

近些年，重金屬污染已經威脅到工農業的持續健康發展，嚴重影響農作物的品質和產量，造成巨大的經濟損失。其中，高毒性、高水溶性的鎘（Cd）容易被植物吸收在體內富集，影響植物正常的生長發育和新陳代謝，最終造成植物死亡[1]。而這些被鎘污染的植物通過食物鏈進入人體后，積累到一定劑量會引起急性或慢性中毒，損害肝臟、腎臟、骨骼，甚至引發癌癥[2]。

Cd脅迫抑制植物根系發育，龐大的根系不僅能夠支持固定整個植株，而且不斷地從土壤中吸收植物生長所必需的營養物質，滿足地上植物組織生長、發育、代謝需求[3-7]，當植物受到土壤中鎘脅迫后，根作為第一道防線直接參與植物對脅迫的應激響應；Cd脅迫誘導活性氧（ROS）的積累，破壞生物大分子及細胞的完整性，影響植物生長必需元素（Fe、Ca、 Mg、P 和 K）和水分的吸收、運輸及抗氧化酶的活性，從而抑制植物生長發育[8-9]；Cd脅迫會抑制植物體內生長素表達分布，有研究表明，當植物受到Cd脅迫后，植物體內的生長素的合成和極性運輸被抑制，主根長度變短，側根數量減少，植物可以動態和差異性的調節生長素相關基因的轉錄，使植物在逆境下更好地適應和生存[10-11]。

植物在受到Cd脅迫后會激活多種響應途徑來抵抗或減弱脅迫程度。植物首先會限制Cd的吸收與運輸，將大部分吸收的Cd儲存在根部液泡中，減少Cd由根系向地上部的轉運[12-13]；然后植物螯合素與Cd結合，降低細胞內游離的Cd2+，減輕對植物的毒害[14]；Cd脅迫誘導ROS在植物體內大量積累，這些ROS隨后被超氧化物氣化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸氧化酶（APX）、谷胱甘肽（GSH）等構成的抗氧化系統所清除進而避免植物受到氧化脅迫[15-18]。

CAT是ROS清除體系的重要組成部分，主要負責清除H2O2 [19]。Cd脅迫能夠不同程度地改變植物體內抗氧化酶的活性，表明包括CAT在內的抗氧化酶參與植物對Cd脅迫的響應[20]。CAT是否參與擬南芥根對Cd脅迫的耐受性響應并沒有被明確報道，擬南芥中已經報道的共有3個CAT基因，其中CAT2是植物CAT的主要形式。因此，借助CAT2缺失突變體cat2，以期探究CAT2是否參與到植物根部對Cd脅迫的調控響應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。擬南芥（Arabidopsis thliana）哥倫比亞野生型（Col-0）、T-DNA插入突變體cat2（SALK_057998）、轉基因材料DR5：：N7-VENUS、cat2 DR5：：N7-VENUS。

1.1.2

主要試劑。MS，KH2PO4，K2HPO4，蔗糖，2-嗎啉乙磺酸，瓊脂粉，氯化鎘（CdCl2），聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），抗壞血酸（ASC），DCFH-DA熒光染料，無水乙醇，次氯酸鈉。

1.1.3

主要儀器。垂直培養板，滅菌鍋，激光共聚焦顯微鏡LSM710，掃描儀，超凈工作臺，冰箱，pH計，紫外分光光度計。

1.2 方法

1.2.1

擬南芥種子消毒。取少量擬南芥種子于離心管中，超凈工作臺內加入70%乙醇浸泡5 min，棄上清；向離心管中加入25%次氯酸鈉，振蕩后靜置15 min，棄掉上清；向離心管中加入1 mL無菌ddH2O振蕩棄掉上清，重復6～8遍；用無菌槍頭將種子均勻地點到1/2 MS固體培養基培養板上，晾干后用透氣膠帶封口，4 ℃冰箱內低溫春化3 d后將培養板放入植物人工氣候室進行生長7 d。生長條件：光照強度分為80～100 μmol/（m2·s）、16 h光照、8 h黑暗、溫度22 ℃（白天）/20 ℃（夜晚）、濕度60%。

1.2.2

擬南芥雜交。待擬南芥cat2和Col-0 DR5：：N7-VENUS正常生長到抽薹開花后，取尚未開花的花苞作為母本，開花勢頭較好的花作為父本。將父本的花粉涂抹在已經去除勢的母本柱頭上，低光3 d后轉正常光照，待莢果成熟后所得即為雜合F1代，自交產生F2代，從中分離出純合的cat2 DR5：：N7-VENUS[21]。

1.2.3

鎘脅迫處理。配制0.1 mol/L CdCl2母液，根據終濃度將一定體積的CdCl2加入1/2 MS培養基中混勻，倒入一次性培養板待凝固后即可使用，試驗使用工作濃度為0、10、30 μmol/L。在超凈工作臺中，用無菌鑷將6 d的苗移到脅迫培養基中處理4 d，掃描后統計根長。

1.2.4

根長統計及分析。掃描儀掃描10 d左右擬南芥整株形態，Image-J測量每棵幼苗的主根長度，Excel對數據進行計算和分析。

1.2.5

ROS染色（DCFH-DA法）。將DCFH-DA母液加入預冷的pH 6.0磷酸鉀緩沖液，配成終濃度為含有100 μmol/L DCFH-DA的熒光探針染液，避光保存；取7 d生長狀態一致的幼苗，低溫孵育15 min后，使用磷酸鉀緩沖液漂洗3～5遍后制片；激光共聚焦觀察熒光信號表達，激發光488 nm，發射光525 nm，單通道掃描[22]。

1.2.6

CAT酶活測定。取200～300 mg 擬南芥根部，液氮充分研磨后加入100 mg PVPP，然后加入1.5 mL 0.1 mol/L NaH2PO4/1 mmol/L EDTA（pH 7.5），1 mmol/L ASC，4 ℃，12 000 g，10 min，吸取1 mL上清液轉移到新離心管中，置于冰上后備用；使用紫外分光光度計測定CAT酶活，反應體系為：880～970 μL緩沖液+20 μL 30%H2O2+10～100 μL酶提取液，充分混勻后，反應90 s。記錄30～60 s斜率數，最后根據公式計算CAT酶活。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Cd對Col-0和cat2根長的影響

使用CAT功能缺失突變體cat2探究CAT是否參與植物根部對Cd脅迫的調控響應。選取垂直培養至6 d、大小均一的擬南芥幼苗，使用濃度為0、10、30 μmol/L CdCl2進行4 d脅迫處理。結果如圖1所示，在1/2 MS培養基上生長的苗的根部隨著Cd濃度的增加，Col-0和cat2根長受到抑制，側根數量減少，地上部出現明顯的黃化表型。在30 μmol/L Cd處理條件下，與對照組相比，Col-0和cat2主根根長抑制率約為23%和16%，并無顯著性差異。表明CAT2功能缺失并不影響擬南芥根部對Cd的耐受性。

2.2 不同濃度Cd對ROS積累的影響

重金屬脅迫能夠誘導植物體內產生大量ROS，破壞植物體內的氧化平衡狀態，造成植物受到氧化損傷。試驗借助激光共聚焦顯微鏡使用DCFH-DA熒光探針對Cd處理的擬南芥根部ROS積累情況進行分析。正常情況下，Col-0根中的ROS積累較弱，而隨著Cd濃度的增加，根中的ROS逐漸增加。30 μmol/L Cd處理后，Col-0根中的ROS有明顯增加；由于cat2中CAT功能缺失，不能及時清除體內產生的H2O2，故體內氧化水平處于較高的水平，從圖2可以看出，cat2在0 μmol/L時根部的ROS水平顯著高于Col-0，當cat2受到Cd處理后，體內的ROS會隨著Cd濃度的積累而增加。10 μmol/L時，和對照組相比，cat2根部的ROS并沒有顯著變化，而在30 μmol/L時，Col-0、cat2根中ROS都明顯增加，與對照組相比，Col-0的ROS增加了114.7%，cat2增加了93.3%，并無顯著性差異。表明CAT2可能不參與Cd脅迫下擬南芥根對ROS積累的調控。

2.3 不同濃度Cd對CAT活性的影響

CAT活性能夠反應出植物對H2O2的清除能力。取Cd處理7 d后的Col-0、cat2根部，測定其根部CAT活性。從圖3可以看出，隨著Cd濃度的增加，cat2根部的CAT活性均沒有明顯的變化。由于CAT2突變，和Col-0相比，cat2根部的CAT酶活性下降約80%，表明Cd脅迫對擬南芥根的CAT活性沒有明顯影響。

2.4 不同濃度Cd對生長素信號的影響

研究發現重金屬脅迫會影響生長素在植物根中的合成、運輸、信號轉導。為了進一步確定CAT2在擬南芥根響應Cd脅迫后生長素的作用，用cat2與生長素報告基因Col DR5：：N7-VENUS雜交從F2代中分離出純合的cat2 DR5：：N7-VENUS，激光共聚焦顯微鏡檢測生長素熒光信號表達。結果如圖4 所示，Col DR5：：N7-VENUS根中生長素表達強烈，但隨著Cd處理濃度的增加，根尖、中柱鞘、外層細胞中熒光強度逐漸減弱，表明Cd脅迫會改變擬南芥根的中生長素信號表達；而對照組中cat2 DR5：：N7-VENUS與Col DR5：：N7-VENUS相比，根中熒光強度降低，30 μmol/L Cd處理后，根中生長素信號隨之降低，進一步分析熒光強度發現，和對照組相比，Col-0和cat2的熒光強度分別下降了29.4%和36.6%，并無顯著性差異。

以上結果表明CAT2缺失可能會減少根中生長素的信號，但并不參與Cd脅迫下擬南芥根部對生長素的調控。

3 討論

在長期的進化過程中植物演化出多種抵抗重金屬的防御機制，多種抗氧化酶參與植物對重金屬脅迫的響應已經得到證實。試驗使用Cd濃度梯度處理模式植物擬南芥Col-0和CAT2功能缺失突變體cat2，分析統計主根長度發現，cat2主根根長的抑制率低于Col-0，說明CAT2可能不參與Cd對擬南芥根長抑制的調節。通過測定不同濃度Cd處理后的Col-0、cat2根中的CAT活性，進一步證明cat2受到Cd脅迫后根中的CAT活性無顯著變化。ROS和生長素作為重要的信號分子，廣泛參與到植物生長發育、新陳代謝、脅迫響應等眾多生理生化反應的調控。分析Cd處理后根中的ROS積累發現，CAT2不參與到Cd脅迫下擬南芥根中對ROS的調控。通過比較根中生長素報告基因的熒光強度，發現CAT2也不參與Cd脅迫抑制根中生長素的信號表達的調控。

研究報道，鎘處理玉米幼苗后，根中CAT的活性和蛋白含量會下調，而轉錄水平會隨著處理時間而增加，并改變轉錄后的蛋白空間結構[23]。當小麥受到Cd脅迫后，CAT活性降低會抑制K+/Na+比率，進而破壞離子通道的正常交換，影響擴膜運輸效率[24]。而該試驗發現擬南芥受到鎘脅迫后，根中CAT酶活并未發生顯著變化，這可能由于不同植物對鎘的耐受能力是不同的，鎘脅迫并未改變CAT轉錄和蛋白表達。

谷胱甘肽（GSH）在植物抵抗逆境脅迫過程中起著重要作用。研究報道，植物中的GSH可以螯合Cu和Cd，降低細胞內游離的重金屬濃度，這些復合物隨之轉移到液泡并排出體外，從而減輕重金屬對植物的毒害作用。擬南芥可能通過GSH途徑參與調控Cd脅迫。

綜上所述，CAT2不參與調控擬南芥根部對鎘脅迫的耐受性，并且不參與ROS積累、生長素信號表達的調控。

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