雌激素對人乳頭狀瘤病毒16型E6基因轉染人永生化表皮細胞效率的影響

盧曉聲，陳菁，趙軍招，呂杰強

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院 生殖中心，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學 第二臨床醫學院，浙江 溫州 325035）

人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種嗜上皮病毒，可導致人類皮膚和黏膜病變[1]。盡管HPV型別眾多，但流行病學研究表明HPV 16感染為全球宮頸癌致病主要型別[2]。HPV早期癌蛋白E6在宮頸上皮細胞癌變過程中起著重要作用。有研究認為宮頸癌是一種激素依賴性的疾病，雌激素在HPV致癌的過程中有協同作用[3]。但是，雌激素水平的升高是否與HPV感染有關目前尚存在爭議。本研究采用不同濃度的雌二醇（17-β-E2，E2）作用于單層培養的人類永生化表皮細胞系HaCat，向細胞內轉染HPV 16型的主要致癌基因E6，模擬HPV感染人類上皮細胞的生物過程，探討雌激素對宿主細胞感染HPV的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞與質粒 HaCaT細胞系購于中國典型培養物保藏中心（武漢大學細胞庫），以10% FBS+1%青霉素/鏈霉素雙抗+高糖型DMEM培養基（美國Gibco公司），于37 ℃，5% CO2，飽和濕度條件下常規培養，隔天換液，7 d 1∶3傳代；含HPV l6 E6的真核表達質粒由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器 E2購于美國Sigma公司；D6922-01質粒提取試劑盒購于美國OMEGA生物技術公司；Lipofectione 2000轉染試劑盒購于美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR試劑盒購于美國MBI Fermentas公司；APO-BRDU?試劑盒購于美國eBioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞生長曲線繪制（細胞計數法）：取對數生長期的HaCat細胞制備細胞懸液，調整細胞濃度為10000個/孔接種于24孔板。細胞貼壁后，分別采用含有10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，0 mol/L的E2培養液培養，每48 h換液1次。每24 h取不同濃度的細胞制備細胞懸液。使用血細胞計數板進行細胞計數（3次/孔并取均值），共計數7 d。

1.3.2 細胞活性測定（MTT法）：制備細胞懸液，以2000個細胞/孔的密度接種于96孔板中。細胞貼壁后分7組，分別加入含10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，0 mol/L（對照組）的E2的培養基以及PBS液（Control）200 μL。在培養24 h、48 h、72 h三個節點，采用MTT試劑盒說明書操作，在酶聯免疫檢測儀上選擇波長490 nm檢測吸光度（A）。

1.3.3 細胞周期分布檢測：取生長對數期HaCaT細胞制備懸液，以2×105個細胞/孔布6孔板，細胞貼壁后用含10-5，10-6，10-7，10-8，10-9， 0 mol/L的E2的培養基以及PBS 3 mL培養72 h。再加入終濃度0.01 mmol的5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU），按照BrdU試劑盒步驟操作并上流式細胞儀檢測。

1.3.4 細胞周期時相檢測：制備細胞懸液，向培養液中加入BrdU，使最終濃度為10 μg/mL。44 h加秋水仙素，使終濃度為0.1 μg/mL。48 h后消化細胞染色體制片。鏡檢100個分裂相，計第1、2、3、4細胞期分裂指數。細胞周期（Tc）=48/[（M1+2M2+3M3+4M4）/100]（h）。

1.3.5 細胞轉染：使用大腸桿菌DH5α感受態細胞將含HPV 16 E6的質粒擴增，按質粒提取試劑盒抽提質粒，以紫外分光光度計測定DNA濃度。將HaCat細胞以5×105個/皿接種，貼壁后以含有10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，0 mol/L的E2培養基培養。在細胞生長豐度達到80%時開始按照轉染試劑盒說明轉染。

1.3.6 Real-time PCR：質粒轉染36 h后收集細胞，采用RNA提取試劑盒提取RNA，按照Real-time PCR試劑盒說明書操作并上機測定RNA。HPV 16 E6引物序列（由大連TAKARA有限公司合成）如下：上游：5’-GCGACCCAGAAAGTTACCACA-3’，下游：5’-GCATAAA TCCCGAAAAGCAAAG-3’。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS13.0軟件對數據進行分析。正態分布計量資料用±s表示，各組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度E2作用下HaCat細胞生長情況 在無E2作用時，HaCat細胞的倍增時間約為24 h。而經過10-7～10-5mol/L的E2作用細胞倍增時間明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，低濃度（10-9～10-8mol/L）E2對HaCat細胞增長的作用差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度E2作用下HaCat細胞的生長曲線

2.2 不同濃度E2作用下HaCat細胞活性情況 當E2濃度在10-7～10-5mol/L范圍時，HaCat細胞活性與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。當濃度為10-9～10-8mol/L時，細胞活性與對照組比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度E2作用下不同時間點HaCat細胞的細胞活性測定

2.3 不同濃度E2作用下HaCat細胞周期分布 各組細胞均以G1期的細胞為主，S期次之，G2期最少，提示E2不改變HaCat細胞的周期時項的比例。見圖3。

圖3 不同濃度E2作用下HaCat細胞周期分布的變化

2.4 不同濃度E2作用下HaCat細胞時相變化 對照組HaCat細胞的平均細胞周期是（18.21±1.09）h。在E2濃度為10-7～10-5mol/L的范圍內細胞周期比對照組短，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 不同濃度E2作用下HaCat細胞周期時相的變化

2.5 不同濃度E2作用下HaCat細胞轉染HPV 16 E6的mRNA表達情況 與對照組比，在10-7～10-5mol/L的E2作用下，轉染HPV 16 E6基因后的HaCat細胞內E6 mRNA表達增高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 不同濃度E2作用下HaCat細胞轉染HPV 16 E6的mRNA表達

3 討論

臨床上HPV感染受到性伴侶、性觀念、生育、性傳播疾病、吸煙等多種因素影響，使流行病學調查對外源性雌激素的接觸很難進行獨立的分析，因此許多調查會得出不同的結論。

有研究認為口服避孕藥是HPV感染的危險因素[4-5]；一項追蹤了9年的隊列研究顯示：服用避孕藥超過15年的女性，罹患宮頸癌及癌前病變的相對危險度分別達到1.8和1.6[6]。然而也有大樣本病例對照研究表明口服避孕藥與HPV感染無明顯關系。2006年的一項隊列研究認為，口服避孕藥的長期使用（10年）并不增加HPV感染的風險，但可能使HPV持續性感染的細胞向惡性轉化[7]。另一項隊列研究也指出：長期口服性激素沒有增加HPV相關的惡性腫瘤風險[8]，采用口服避孕藥和使用宮內節育器進行避孕的2組女性之間的HPV感染率也并無統計學差異[9]。

較多組織學、病理學上的研究則支持性激素與HPV感染有關。既往文獻通過檢測正常宮頸上皮、非典型增生及宮頸癌組織中雌激素受體（estrogen receptor，ER）及HPV的表達情況，發現ER陽性患者更易發生HPV感染[10]。也有研究顯示雌、孕激素可增強HPV 16癌基因E6和E7的轉錄活性[11]。最有力的證據來自于HPV 16 E6/E7轉基因小鼠，它們在胚胎時期就開始表達HPV 16 E6/E7基因，但很少自發宮頸癌。在使用E2干預6周后，這些小鼠均出現了宮頸癌[12]。

本研究將單層體外培養的細胞加以E2的刺激，觀察其對HPV 16 E6基因轉染影響，發現一定濃度的外源性雌激素可使宿主細胞的生長加速，活性增加，轉染后HPV 16 E6的表達也相應增加。表明雌激素水平的升高可能會增加HPV感染的風險。

HPV E6蛋白會與抑癌基因p53結合，使之降解，導致細胞周期的調控失常而誘使惡性腫瘤的發生[13]。細胞周期蛋白Cyclin D1是細胞周期G1/S期的關鍵調控因子[14]。雌激素可上調Cyclin D1的表達，促進細胞增殖[15]。本研究中，雌激素促進HaCat細胞的增殖，使其細胞周期縮短，與雌激素對細胞周期的正性調控因子的促進作用相符。但雌激素并沒有改變該細胞細胞周期的時相，其作用機制仍有待于進一步研究。

HPV只能感染復層上皮的基底層細胞，而無法感染分化終末期的細胞，提示HPV感染與宿主細胞的細胞周期有關[16]。PYEON等[17]的研究發現：宿主細胞必須進入M期才能啟動HPV衣殼基因的轉錄。本研究中，將HaCat細胞暴露在一定濃度范圍內的E2中，HaCat細胞的數目和活性增加，證明E2具有促進靶細胞增殖的能力。當細胞周期的進程縮短，數目增加，進入M期的細胞數目增多，活性增強，則受到HPV感染的幾率也就越大。因此E2作用后HaCat細胞轉染HPV 16 E6的效率會隨著E2濃度的升高而增加。

雌激素還可通過調整多種炎癥因子和抗原遞呈復合物的表達，促使G1期的細胞生長，促進病灶的增殖[18]。雌激素對HPV 16 E6整合進入宿主DNA的過程是否也存在著對炎癥因子的調節有待進一步探索。

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