少精子癥患者精子魚精蛋白表達及染色質包裝質量

洪丹，樓哲豐，鄭九嘉，黃學鋒，金龍金

（1.溫州醫科大學 檢驗醫學院、生命科學學院，檢驗醫學教育部重點實驗室，浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 生殖醫學中心，浙江 溫州 325015）

全球有近15%的不孕不育夫婦，男性因素約占50%[1]，其中男性不育患者中有14%～15%伴有精子數量或質量異常[2]。魚精蛋白作為成熟精子中主要的核蛋白，包括魚精蛋白1和魚精蛋白2家族，分別由PRM1和PRM2編碼[3]，其轉錄、翻譯及翻譯后修飾均涉及復雜的調控機制[4-5]，與精子形成、精子染色質結構異常、男性不育密切相關[6-7]。TBP相關因子2（TBP related factor 2，TRF2）是哺乳動物睪丸組織中特異性表達的調控因子，對精子形成過程中某些特異性基因的轉錄調控起關鍵作用[8]。本研究通過檢測PRM1、PRM2、TRF2的表達以及精子染色質包裝質量，探討成熟精子中轉錄因子TRF2、魚精蛋白和染色質包裝質量與少精子癥的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 28例少精子癥患者、16例畸形精子癥患者和15例正常對照者標本來自溫州醫科大學附屬第一醫院生殖中心。所有標本在采集前禁欲3～5 d，采集后在37 ℃、20～30 min完全液化，采用計算機輔助精液分析系統（CASA）分析和改良巴氏染色法，按WHO（第五版）標準進行診斷。此外，入選的所有標本經鏡檢驗證無圓細胞及白細胞污染，同時均需符合：無生殖系統感染、無內分泌和免疫系統疾病、無隱睪和精索靜脈曲張、抗精子抗體陰性。所有標本來源經本人知情同意并簽署知情同意書。收集的標本分裝后用于后續各項實驗。

1.2 主要試劑 Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自日本Takara公司，色霉素A3（chromomycin A3，CMA3）染料購自美國Sigma公司，DEPC水購自上海生工生物工程股份有限公司，其他試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 精子純化：精液標本離心后棄上清，PBS吹打混勻，離心，棄上清；重復2～3次。

1.3.2 精子RNA提取：重懸純化好的精子沉淀，加入Trizol，混勻后靜置；加入氯仿混勻后靜置再離心；吸取上層水相后加入等體積的異丙醇，混勻靜置后離心；棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，混勻后離心，棄上清，重復1次；沉淀干燥至半透明，用DEPC水溶解；檢測RNA濃度、純度及完整性。

1.3.3 反轉錄反應：配置反應體系，37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s反應，產物作為后續實驗的模板。

1.3.4 qPCR：通過Primer bank搜索或Primer Premier5.0軟件設計目的基因引物，使用NCBI數據庫進行blast比對后，交由華大基因公司合成。引物序列（5’→3’）如下：PRM1 F：CAGCCCACAGAGTTCCA CCT，R：GCACCTCATGGCTCTCCTC；PRM2 F：GCAAGAGC AAGGACACCAC，R：AGCCTCTGCGATGCCTCCT；TRF2 F：AACAACAAAGCAAGGAAGACGGAGT，R：AAGGAGAAGCTGGA GGACAAGGAT；GAPDH F：GCCAGTGGACTCCACGAC，R：CAACTACATGGTTTACATGTTC。配置反應體系，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、循環40次。

1.3.5 CMA3染色：配置CMA3染料，純化的精子沉淀調成40×106/mL的精子懸液混勻后均勻地涂在潔凈的載玻片上；干燥后固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）中固定10 min；PBS反復沖洗，干燥后加50 μL CMA3染料均勻覆蓋涂片，避光染色20 min；PBS反復沖洗，干燥后普通熒光顯微鏡觀察。以發出明亮黃色熒光的精子為陽性，暗淡熒光或是無熒光的為陰性。每例標本至少計數200個精子，CMA3陽性率=陽性精子數/（陽性精子數+陰性精子數）×100%。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標本資料 少精子癥組平均年齡為（30.36±0.97）歲，畸形精子癥組為（32.50±1.28）歲，正常對照組為（30.00±1.07）歲。各組精液參數見表1。

表1 少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組精液參數（±s）

表1 少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組精液參數（±s）

2.2 qPCR結果 以GAPDH為內參基因，用2-ΔΔCq法分別計算3組PRM1、PRM2和TRF2 mRNA相對表達水平，結果顯示，少精子癥組PRM1和PRM2 mRNA相對表達量分別為正常對照組的25%（P＜0.05）和20%（P＜0.05）；畸形精子癥組PRM1和PRM2 mRNA相對表達量分別為正常對照組的66%和69%，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1A-B。與正常對照組相比，少精子癥組和畸形精子癥組TRF2 mRNA相對表達量分別為正常對照組的128%和119%，差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖1C。

2.3 CMA3染色結果與陽性率計算 CMA3染色結果顯示少精子癥組CMA3陽性率為（20.47±1.19）%，畸形精子癥組為（14.31±2.01）%，正常對照組為（10.69±1.45）%；少精子癥組陽性率是正常對照組的191%（P＜0.001）；畸形精子癥組陽性率是正常對照組的134%（P＞0.05）。見圖2。

圖1 3組PRM1、PRM2和TRF2 mRNA相對表達量比較

3 討論

超過一半的男性不育患者病因尚不明確，先天或后天因素都能導致不育的發生。輔助生殖技術尤其是胞漿內單精子注射技術，已能幫助部分由男性因素引起不育的夫婦獲得子代[9-10]。然而該技術可能逃避受精過程中對潛在具有遺傳缺陷的異常精子的自然選擇機制，沒有對潛在的遺傳缺陷進行全面的篩查，因此有必要深入研究精子功能。

精子質量低下是造成精子功能異常和男性不育的重要原因。研究表明，前來就診的男性不育患者中約有30%為不明原因的少精子癥或無精子癥[11]，由于本研究收集的精液標本中少精子癥常伴隨畸形精子癥，因此本研究分別檢測少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組中魚精蛋白表達情況并初步探討其中可能的發生機制。

精子發生包括精原細胞的有絲分裂、精母細胞的減數分裂和精子形成。精子形成的特征性事件之一是核蛋白組型轉換，與核DNA結合的組蛋白被過渡蛋白取代，最終被睪丸特異性的魚精蛋白取代，這一過程能夠使細胞核濃縮形成精子特殊的染色質結構，從而保證遺傳信息的傳遞[12]。研究表明，魚精蛋白2表達水平降低導致的雄性小鼠不育與PRM1和PRM2突變有關，二者任一等位基因突變都會導致單倍型的缺乏[13]。本研究針對魚精蛋白（PRM1和PRM2）轉錄水平的研究發現，少精子癥組中PRM1和PRM2 mRNA相對表達量分別為正常對照組的25%與20%，表達顯著降低；而畸形精子癥組則無統計學差異。提示PRM1和PRM2 mRNA表達量減少可能是成熟精子數量減少而非成熟精子形態異常的原因。

圖2 CMA3染色結果及陽性率比較（×400）

那么魚精蛋白表達異常是如何影響下游水平，又是如何受到上游調控，從而使得成熟精子數量減少？一方面，魚精蛋白對于精子核結構的穩定和核染色質的濃集具有重要作用[14]。本研究通過CMA3染色檢測精子染色質包裝質量，評估精子內魚精蛋白的表達水平[15]，發現少精子癥組中CMA3陽性率顯著高于正常對照組，畸形精子癥組與正常對照組之間則無統計學差異，說明染色質包裝異常可能是成熟精子數量減少而非成熟精子形態異常的原因。魚精蛋白是染色質結構成分之一，其表達減少使得核蛋白與DNA親和力降低，從而影響DNA-魚精蛋白復合體的形成；更有研究表明，PRM2敲除小鼠精子細胞染色質濃縮不全、DNA損傷加劇，即使通過胞漿內單精子注射技術都無法生育[16]。結合本研究結果提示，魚精蛋白表達減少可能是通過影響精子染色質包裝結構，使得精子形成過程異常，而這可能是成熟精子數量減少的原因。另一方面，精子形成中（除基本轉錄因子之外）許多睪丸特異性的轉錄因子和一些基本轉錄因子的特異轉錄本形式，或通過調節PRMs轉錄活性，或在轉錄后修飾等方面發揮重要作用[17-18]。睪丸特異性調控因子TRF2能夠結合轉錄因子 IIA和TF IIB形成大分子蛋白復合體，抑制RNA聚合酶 II的轉錄[19]。我們的結果顯示，少精子癥組與正常對照組、畸形精子癥組與正常對照組的TRF2 mRNA表達水平均無統計學差異。MARTIANOV等[20]對基因敲除小鼠的研究顯示，單倍體精子中TRF2 mRNA表達有2個高峰期：圓形精子細胞和延長形精子細胞。本研究檢測到成熟精子中TRF2 mRNA表達量明顯低于PRM1和PRM2 mRNA的含量，提示在成熟精子中對TRF2的檢測可能沒有實際意義。

綜上所述，魚精蛋白（PRM1和PRM2）mRNA表達量減少，可能影響精子染色質包裝，使得精子形成過程異常，這可能是成熟精子數量減少的原因。成熟精子中TRF2 mRNA表達量較低，可能與其僅在精子形成過程早期表達有關，可通過檢測生精細胞中TRF2以及其他階段特異性表達基因[21]表達，研究其與少精子癥、魚精蛋白的相關性，從而進一步探討調控魚精蛋白表達的相關機制。

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