雞免疫禽流感（H5+H7）二價滅活苗后的抗體監測

黃西梅，黃金山，李佳榮，盧蓮珍

（1.廣西百色市右江區動物疫病預防控制中心，百色 533000；2.百色農業學校，百色 533000）

2017年，按農業部的疫情通報，隨著家禽高致病性的H7N9流感病毒株的出現，陸續有雞群感染高致病性H7N9流感病毒引起大量的死亡，高致病性H7N9流感呈現出區域性流行的態勢。H5亞型高致病性禽流感的流行趨勢總體平穩，未出現大范圍的暴發，但仍有局部散發疫情的發生。H5和H7亞型禽流感在我國同時流行且流行毒株復雜多樣，嚴重威脅著我國家禽養殖和公共衛生的安全，使得疫病防控形勢更加嚴峻。

目前，疫苗免疫是預防和控制禽流感發生的最有效途徑，而免疫后抗體水平的高低是評估實際免疫效果的重要指標[1]。

右江區為了抓好家禽H7N9防控，于2017年8月開始推出使用禽流感（H5+H7）二價滅活苗[2]，為了掌握禽流感（H5+H7）二價滅活苗在右江區當地家禽品種的不同注射部位產生的免疫應答和抗體消長情況，提供可操作的免疫方法和免疫程序。特進行本次試驗研究，供廣大養殖戶和動物防疫工作者參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗疫苗

重組禽流感（H5+H7）二價滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），批號 2017024，哈爾濱維科生物技術開發公司。

1.1.2 試驗雞群分組及免疫次數情況

選用14日齡右江區本地土雞 100只，分為2組，其中頸部皮下注射2組，胸部肌肉注射2組。共4個組，試驗期 105 d，詳見表1。

表1 實驗動物分組情況

1.1.3 試驗雞群免疫時間和免疫劑量情況

2017年8月20日對 14日齡的雞2個試驗組進行第1次免疫，免疫劑量按疫苗說明書使用，雞0.3 ml/ 只，9月17日對第 2 組 42日齡的雞進行第2次免疫，免疫劑量按疫苗說明書使用，雞 0.5 ml/ 只，詳見表1。

1.1.4 血清樣品

對第1試驗組雞群1次免疫后，7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、60 d、75 d、90 d 分別隨機采集血清各 50 份，第2組2次免疫后，7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、60 d、75 d、90 d 的 各 組分別隨機采集血清各 50 份，共計血清樣品 900 份。

1.1.5 診斷試劑

HI 試驗禽流感病毒H5亞型（Re－8株）抗原，批號2017001，陽性血清（批號 2016003） HI 試 驗禽 流 感 病 毒 H7 亞 型 抗 原、批號 2017012，陽性血清（批號 2017004）以上試劑均由哈爾濱維科生物技術開發公司生產，1% 的非免雞紅細胞自制。

1.2 方法

1.2.1 免疫方法

雞 1～2 組在 14日齡免疫注射疫苗 0.3 ml，雞 2組 42日齡免疫注射疫苗 0.5 ml。

1.2.2 采血部位

21日齡以下的雞鴨在心臟采血，28日齡以上的雞鴨在頸靜脈采血。

1.2.3 檢測方法

按照 GB/T18936—2003 頒布的高致病性禽流感診斷技術方法[3]，用 96 孔微量反應板進行微量血凝抑制（Heamoglutination Inhibition，HI）試驗，試驗用抗原稀釋倍數為 4HAU，以完全抑制 4HAU抗原的血清最高稀釋倍數作為 HI 滴度。并按常規方法設置陰性和陽性對照。

1.2.4 結果判定

只有陰性對照孔血清滴度不大于 22，陽性對照孔血清誤差不超過 1 個滴度，試驗結果才有效。

HI 價小于或等于 22判定 HI 試驗陰性；HI 價等于23為可疑，需重復試驗；HI 價大于或等 24為陽性，判為免疫合格。

2 結果與分析

2.1 免疫抗體

“H5+H7二價滅活疫苗”免疫后可刺激機體產生良好的免疫應答，進而產生高水平的免疫抗體。“（H5+H7）二價滅活疫苗”在一免后 14 d可產生較高的抗體、35 d達到抗體峰值，到 60 d仍維持較高的抗體水平。

2.2 不同免疫次數的抗體效價分布情況

通過表2 可知，雞二免后H5和 H7抗體合格率為 97.8%和94.4%，而一免的只有 72.22% 和 67.56%，差異極其顯著（P＜0.01）。通過比較不同免疫次數的抗體效價分布情況，發現二免后的雞禽流感H5和 H7抗體平均滴度為 8.81 和 7.64 ，比一免高 4.05 個滴度和3.61個滴度，詳見表2、3。

表2 1組免疫后抗體的檢測結果統計

表3 2組免疫后抗體的檢測結果統計

免疫后H5N1Re-8株HI抗體消長曲線

免疫后H7N9－Re1株HI抗體消長曲線

通過繪制雞一免和二免后的抗體消長曲線，而雞在一免后 21 d抗體方能合格，并且持續到一免后 90 d均合格。而在二免后的各個時間點采血，抗體均維持高水平，詳見表2、3。

2.3 兩者的差異

相比之下，H5N1-Re-8株的HI抗體效價比H7N9-Re1株的高，這應與不同病毒2株之間的不同特性有關，所以，在檢測HI抗體進行免疫評估時要注意兩者的差異。

3 討論與結論

目前，疫苗免疫是防止禽流感暴發的主要措施。因此，我們進行了禽流感滅活疫苗對雞的抗體產生規律的探索，為制定禽流感免疫程序和防控禽流感提供科學依據。

本研究發現，“H5+H7二價滅活疫苗”免疫應答性顯著，臨床使用安全。家禽進行一次免疫后，21 d起平均抗體滴度能達到 4log2 以上，但總抗體合格率基本在 60%～70%，總平均抗體滴度在 4log2 左右，而二次免疫后，總抗體合格率能達到 95% 左右，平均抗體滴度在 8log2 左右。在對家禽進行首次免疫后由于免疫系統是初次應答，加上母源抗體的干擾，因而抗體效價普遍低；由于在首次免疫后，機體對此種疫苗已具有免疫記憶，當再次用此種疫苗進行加強免疫時，機體可迅速產生比上次免疫更多的抗體，故抗體的效價普遍較高。但在生產中：一方面，很多養殖戶防疫意識不強，認為由于飼養周期短，免疫過一次就可以達到預防目的，對防疫人員進村入戶開展二免不配合不支持，產生抵觸情緒；另一方面，在給家禽注射疫苗時，由于抓捉和注射疫苗時疼痛與疫苗的副作用，家禽應激反應很大，可導致生產性能下降和飼養成本的增加。家禽只進行一次免疫，必然造成抗體滴度較低的現象，難以保護家禽群體，潛在受野毒攻擊暴發疫情的威脅。應加大對養殖戶和防疫員的培訓力度，強化防疫意識，確保免疫質量。結合本試驗研究結果，推薦右江區在14日齡首次免疫禽流感（H5+H7）二價滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），頸部皮下注射雞 0.3 ml，42日齡二次免疫禽流感（H5+H7）二價滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），頸部皮下注射雞 0.5 ml，使雞群在較長時間內保持較高的抗體水平。鑒于（H5+H7）二價滅活疫苗”剛剛推出使用，需要對其免疫效果加強評估。

[1] 吳庭才，張春杰，郭務鵬,等．禽流感母源抗體消長規律和免疫保護抗體臨界值的測定[J]．廣東畜牧獸醫科技，2007，32（3）：24-28．

[2] 中華人民共和國農業部，農業部《關于切實做好廣東廣西H7N9免疫工作的通知》（農辦醫[2017]23號）．

[3] GB/T18936．高致病性禽流感診斷技術[S]．北京:中國標準出版社，2003．

[4] 刑清潔，景建江，楊雪珍,等．H5+H7禽流感疫苗免疫抗體檢測試驗報告[J]．今日畜牧獸醫，2018（1）：46．