紫花苜蓿高效共生固氮根瘤菌的篩選

楊淑君，何永攀，張學洲，蘭吉勇，張薈薈，柯梅

（1.新疆畜牧科學院草業研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆生產建設兵團第十二師三坪農場，烏魯木齊 830000）

根瘤菌是作為廣泛地分布在土壤當中的一類革蘭氏的陰性細菌[1-2]。根瘤菌能夠侵染豆科植物的根部，并在其根部形成根瘤[3]。對空氣當中分子態的氮進行固定以形成氨類，從而為豆科植物提供起氮素的營養支持。根瘤菌和豆科植物的和諧共生是自然界當中生物固氮的一個最強體系[4]。其所固定氮占生物的固氮總量超過65%。當前全世界的各種類的蛋白食物當中，約有超過20%是源于豆科植物[5]。在我國已知的豆科植物種類大概接近1400種。其中從草本豆科到喬木豆科，豆科植物的生態、形態以及其生活習性都具有多樣化。其中的大部分也都可以為根瘤菌所感染并且在根部結瘤。根瘤菌的固氮不僅可以提高對豆科植物的產量，改善植物的品質，同時也可以節約氮肥并且降低生產的成本，同時提高土壤的肥力，改善土壤的結構等效果。根瘤菌的作用為該土地的后茬作物充分的提供了純天然的氮素營養。但是根瘤菌也并不意味對于所有的寄主豆科植物都能實現提高其宿主的產量或者品質。根瘤菌的結瘤過程是一個競爭的過程，有眾多的因素都影響著根瘤菌的結瘤以及其與宿主植物的共生同氮的效率。眾多因素也包括了土壤的條件、土壤中的土著種根瘤菌、宿主植物的品種、植物和根瘤菌相互的作用等等。因此，對于豆科宿主植物與其根瘤菌的共生固氮優良組合的篩選，在一直以來也是生物固氮這一研究領域的一個重要熱點。

紫花苜蓿不僅能為我國的草地、畜牧業發展供給重要、優質的蛋白類飼料，且由于有固氮菌的固氮作用，其也能起到土壤培肥，對生態環境進行改善作用，從而對提高中低產田利用率起到明顯的作用。本文通過研究紫花苜蓿接種的8株根瘤菌，在溫室的條件之下生長情況以及其結瘤的具體狀況，篩選出具備最佳的共生匹配關系的固氮根瘤菌的菌株。以實現增產的效果，且為紫花苜蓿的高效固氮根瘤菌篩選的理論依據提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

紫花苜蓿，由本所昌吉綜合試驗站種植并供種。

1.1.2 供試菌株

固氮菌株由我所前期項目篩選保存根瘤菌。

表1 8株供試菌株表

1.1.3 土壤

X牧區試驗地的表土（該廠種過相關的豆科牧草，且前茬為禾本科的草本植物），本研究選用的土壤為普通壤土，同時土質相對均勻一致，土壤中pH 8.2，全氮含量 0.062%。

1.1.4 培養基

應用實驗室自制固體培養基（l l蒸餾水、瓊脂粉 15 g、甘露醇 10 g、K2HPO4為 0.25 g、KH2PO4為 0.25 g、MgSO4為0.2 g、NaCl為0.1 g、CaC03為3 g），pH控制 6.8～7.2 之間。

1.2 方法

1.2.1 活化根瘤茵

8株供試菌株分別接種于克氏瓶中培養基上，28℃溫度下培養2 d至其對數生長期，之后那個100 ml的無菌水對菌體洗下并裝入到無菌的三角瓶當中。通過旋渦振蕩法打散菌體之后取其中的一部分測定OD值，之后使每毫升的菌懸液當中根瘤菌個數達到20億。

其中的計算公式為：根瘤菌數=各方格中根瘤菌數的平均值/16*4000*1000*稀釋倍數。

1.2.2 種子的處理與根瘤菌的接種

紫花苜蓿種子經過濃度 95%的乙醇進行處理10 min后。在無菌水下5～6次沖洗后再用濃度0.1%HgCl表面消毒，再在無菌水下5～6次并置于培養皿當中，于28℃的培養箱進行2 d培養催芽。后于培養基中加入備用菌懸液，再加發芽一致，根的長約為1 cm紫花苜蓿種子，進行浸泡達15 min后用鑷子進行夾取，并植入裝一定土壤塑料花盆種植。該方法分別對8種各不同的根瘤菌接種進行處理，每中各做3個重復實驗，并以不進行接種植株作為對照，同樣3個重復實驗。統一培養。

1.3 測定接種效果

在接種的45 d之后進行收獲。將紫花苜蓿的地上部（第一片子葉的葉痕處上端）剪下后，分別進行裝袋，處理稱干重；收獲時再把紫花苜蓿根系用水進行洗凈，測每盆植株的總根瘤數量。

1.4 數據處理方法

用SPSS19.0統計學軟件結合EXCEl表格進行數據處理分析。

2 結果分析

2.1 紫花苜蓿接種后生長的效應

紫花苜蓿接種8株不同的根瘤菌之后，其干草重與對照間差異顯著(P＜0.05)，其中（ACCC04、ACCC03和ACCC05）的菌株干草重顯著的高于其他的處理。其中增幅最大的是ACCC04，干草重達3.72 g，高于對照26.33%。增幅最小為ACCC08。高于對照3.82%，在接種了根瘤菌后，對紫花苜蓿的生長影響不明顯，只有ACCC05存在顯著差異，其他的菌株間均無明顯的差異，但8個處理的干根重均顯著大于對照，說明根瘤菌的接種對于紫花苜蓿生長具一定的促進作用。

2.2 紫花苜蓿接種后固氮效應

接種了根瘤菌之后，能顯著的提高了紫花苜蓿結瘤的能力。接種了根瘤菌后紫花苜蓿結瘤的能力也存在差異，其中31菌株根瘤數最多，其次是ACCC08和ACCC05根瘤數，比對照增加41.33%、29.43%與25.43%。而根瘤數增加最少的菌株是ACCC04，對比對照僅為3%。

上述的定指標：接種ACCC 44根瘤菌后紫花苜蓿的效果最佳。可有效的增加紫花苜蓿的產草量。是紫花苜蓿最佳的一個匹配菌株。

3 討論

本研究選取8株根瘤菌對紫花苜蓿接種，8株根瘤菌的接種效果存在明顯的差異；在接種之后的干草重、根瘤數與對照相比分別各增加3.82%～26.33%、3.00%～41.33%；篩選出與紫花苜蓿最佳的共生匹配的固氮根瘤菌ACCC05，該固氮根瘤菌菌株能夠顯著的增強其固氮效果，在提高草產量選擇該固氮菌具一定生產與應用的價值。

[1] 韓志順，鄭敏娜，梁秀芝．接種不同根瘤菌對紫花苜蓿固氮效能及生物量的影響[J]．華北農學報，2016，31(4):214-219．

[2] 朱秋蓮，邢肖毅，程曼，等．寧南山區典型植物根際與非根際土壤碳、氮形態[J]．應用生態學報，2013，24(4):983-988．

[3] 孫向輝，騰應，駱永明．接種根瘤菌對紫花苜蓿吸收轉運PCB28及抗PCB28污染能力的影響[J]．河南農業科學，2014，43(3):65-69.

[4] 王軍．不同施肥水平下接種AMF和根瘤菌對紫花苜蓿生長及養分吸收的影響[D]．北京：北京林業大學，2012．

[5] 楊何寶，李繼泉，王俊娟，等．施肥和苜蓿接種根瘤菌對苜蓿生長及鐵尾礦砂基質理化性質的影響[J]．草業學報，2016，25(2):68-76．