酸奶中常見真菌的分離、鑒定與快速檢測

杜 瑩,潘佩平,李 敏,李 瑤,范曉軍*

(1.山西省生物研究所,山西 太原 030006；2.太原理工大學 化學化工學院,山西 太原 030024)

乳制品是一種營養豐富,容易被人體消化吸收的天然食品,隨著人們生活水平的提高,相關產品已經成為生活中常見的健康食品。但是營養豐富的乳制品也是各種微生物青睞的溫床,這導致乳制品的保質期非常有限,比如經巴氏殺菌的乳制品保質期一般不超過7 d(巴氏鮮奶占全球液態奶70%的市場份額)［1］,近些年市場占有量越來越大的發酵酸奶,其保質期最多也只有21 d［2］。

另一方面,國家《食品安全法》和《企業生產乳制品許可條件審查細則(2010版)》中明確要求企業必須對所生產、加工的乳制品進行出廠前微生物檢驗,包括5種指示菌和5種致病菌的檢測［3］。目前乳制品企業基本都是采用傳統的平板培養法來檢測微生物,這種方法的檢測周期一般在3～5 d左右,甚至有些致病菌不能僅憑菌落形態來判定,需要配合其他生化反應試驗做進一步鑒定,這無疑又增加了檢測周期。作為一種快速、準確的檢測方法,熒光定量聚合酶鏈式反應(realtime-fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR)技術已經被權威部門認可并納入部分食品微生物檢測國標中［4］,尤其是近些年越來越多的國家標準中采納了這一方法。如進出口行業對難于培養的霍亂弧菌、副溶血性弧菌等微生物的檢測都是采用熒光定量PCR技術［5-6］。

熒光定量PCR因其準確、快速等特點,已用于乳品中微生物快速檢測。張巧艷等［7］將這一技術應用于乳制品中沙門氏菌的檢測,將沙門氏菌的檢測時間縮短至3 h,但該方法在3 h的檢測下限為100 CFU/mL,在微生物含量較低的情況下該方法仍然存在一定的假陰性。在酵母的快速檢測上,夏乾峰等［8］建立了一種可以檢測5種酵母菌的熒光定量PCR方法,其優化后的熒光定量PCR檢測方法的靈敏度為5CFU/mL,然而該方法的檢測對象為純化后的酵母菌,未深入研究樣本類型對檢測靈敏度的影響。顯然,酸奶作為一種高蛋白含量的樣本類型,在DNA提取過程中存在高濃度蛋白背景污染的問題,此外,真菌具有較為致密復雜的細胞壁結構,這些因素都會影響對酵母、霉菌DNA檢測的準確性。目前,使用熒光定量PCR技術檢測乳制品中真菌的研究還鮮有報道。本研究首先對導致酸奶腐敗變質的微生物進行分離、鑒定,通過改良的DNA提取方法,獲取酸乳中微生物總DNA,建立了污染微生物的熒光定量PCR標準檢測曲線,形成了一套乳制品常見微生物的快速檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成品酸奶：市售某品牌酸奶；SYBR Green-qPCR擴增試劑：北京天根生化科技有限公司。

孟加拉紅固體培養基：稱取蛋白胨5.0 g,葡萄糖10.0 g,磷酸二氫鉀1.0 g,無水硫酸鎂0.5 g,瓊脂20.0 g,孟加拉紅0.033g,加入蒸餾水中,加熱融化,補足蒸餾水至1 000 mL,分裝后121℃滅菌20 min。傾注平板前,用少量乙醇溶解0.1 g氯霉素加入培養基中。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-30S2型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；Mastercycler pro SPCR儀：艾本德中國有限公司；WD-9413C型凝膠成像分析儀：北京市六一儀器廠；DH-360電熱恒溫培養箱：北京中興偉業儀器有限公司；CFX96Touch熒光定量PCR儀：美國伯樂生命醫學產品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

取10 mL經過巴氏滅菌的新鮮制備的酸奶,開蓋置于空氣中,室溫放置7 d。待空氣中的微生物已經自然沉降至酸奶上并形成肉眼可見的菌落后,挑取酸奶上出現的不同形態的菌落至5 mL滅菌蒸餾水中,振蕩混勻后取1 mL涂布至孟加拉紅固體培養基上。28℃條件下恒溫培養5 d。固體培養基上長出菌落后挑取至孟加拉紅液態培養基中擴培。

1.3.2 菌種鑒定

取1 mL經過步驟1.3.1制備的菌液,離心后將沉淀物置于-80℃中冷凍30 min,隨后采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide,CTAB)法抽提沉淀菌體的DNA。用真菌ITS擴增通用引物ITS5(5‘-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘)和ITS4(5‘-TCCQCCGCQTATTGATATGC-3‘)對提取的DNA進行擴增［9］,擴增產物經純化后進行Sanger上機測序。將測序結果在NCBI數據庫中Blast同源比對檢索,查找與被測菌種在ITS序列相似性最高的物種。

1.3.3 DNA條形碼確定

在進行物種DNA鑒定時,首先選擇最佳的DNA擴增片段,不同的DNA序列存在不同的擴增效率和區分層次［10］。針對1.3.1分離鑒定出來的微生物,為了選擇一個合適的基因片段作為熒光定量PCR檢測靶點,本研究選取了4個較為常用的基因片段進行擴增效率比較,分別為β-tubulin［11］、RPB1［12］、LSU［13］、ITS,針對四個片段設計的PCR引物及序列見表1。

表1 PCR引物序列設計Table 1 Sequences design of PCR primers

1.3.4 熒光定量PCR檢測體系

將擴培的真菌原液進行梯度稀釋,分別稀釋10、102、103、104倍,取104倍稀釋的菌液100 μL涂布于孟加拉紅固體培養基上,28℃條件下培養至形成了明顯菌落并且菌落未連在一起的時候,對菌落進行計數。

將上述梯度稀釋后的菌液各取100μL,加入到500μL滅菌酸奶樣品中,充分混勻后12 000 r/min離心5 min,去上清液,將沉淀物放入-80℃冰箱中冷凍30 min后進行液氮研磨,用1.3.2中描述的方法抽提各稀釋濃度梯度下的微生物DNA。用1.3.3實驗步驟確定的最佳擴增基因片段,對各濃度梯度下提取的DNA進行SYBRGreen-qPCR擴增,記錄每個反應的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數Cq值及對應的熒光檢測值。建立檢測菌數與Cq值的關聯曲線。結合DNA提取的洗脫液體積70μL及PCR時可用最大模板量18μL,指出檢測菌數X的計算公式為N×18/70×r,其中N為平板計數結果,r為稀釋倍數［14-15］。

SYBRGreen-qPCR的反應體系(20μL)：EvaGreen 2×qPCRMasterMix10μL,正向引物10μmol/L 1μL,反向引物10μmol/L 1μL,基因組模板18μL。SYBRGreen-qPCR反應條件為：95℃、3 min,進入36個循環(95℃、15 s,56℃、30s,72℃、30 s),在72℃延伸階段進行熒光采集,最后72℃恒溫5 min。

2 結果與分析

2.1 微生物分離與鑒定結果

酸奶置于空氣中靜置7 d后,發現9個肉眼可見的菌落,將其轉移至孟加拉紅培養基純化、擴培,經ITS序列鑒定這9個菌落分別屬于紅酵母(Rhodotorula sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)這三種菌種(菌落形態參見圖1),其中紅酵母出現的概率最大,具體真菌鑒定結果參見表2。

圖1 三種純化真菌平板菌落形態Fig.1 Colonial morphology of three purified fungiplates

表2 酸奶污染真菌基于ITS序列鑒定結果Table 2 Identification results of fungiin yogurt based on ITS sequence

由此可見,酸奶常見的真菌污染類型以酵母和霉菌為主,其中酵母出現概率更大,在酸奶的實際的加工生產環境中,要重點預防空氣中紅酵母(Rhodotorula sp.)和根霉菌(Rhizopus sp.)的污染。

2.2 檢測DNA條形碼的確定

圖2 酵母菌N1及根霉菌X1 4種PCR產物凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of four PCR products from yeast N1 and Rhizopus sp.X1

分別提取表2中的編號為N1酵母菌和編號為X1根霉菌基因組,作為PCR擴增模板,用表1中設計的PCR引物分別進行PCR擴增及電泳檢測,以選取最佳的DNA檢測片段。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測結果如圖2。由圖2結果可知,ITS和LSU這兩個基因片段在酵母和霉菌均呈現較好的擴增效果,而另兩種基因片段擴增失敗,因此將ITS和LSU作為快速檢測酸奶中真菌的DNA條形碼。

2.3 熒光定量PCR快速檢測體系

在完成各菌液濃度梯度的技術和計算后,將其回接至酸奶中,按照上述方法提取真菌基因組DNA,利用ITS片段作為檢測靶點,進行熒光定量PCR檢測并收集相關數據,各濃度梯度的真菌均得到了完整的擴增曲線,具體檢測菌數與Cq值參見表3。

表3 不同濃度的真菌檢測數量與Cq值Table 3 Determination results of different fungiconcentration and Cq value

將表3兩種真菌的被檢數量對數值lgX(x)與檢測采集的Cq值(y)進行關聯分析,并得出兩者之間的擬合關聯方程式,具體關聯結果分別參見圖3。

圖3 紅酵母(A)與根霉菌(B)檢測數量與Cq值關聯曲線Fig.3 Correlation curve between count and Cq value of Rhodotorula sp.(A)and Rhizopus sp.(B)

通過圖3的趨勢線可知,隨著真菌數量的增加,檢測系統的熒光值也在隨之升高,這說明熒光強度與真菌數量存在很強的關聯性,通過繪制與熒光值相對等的Cq值和真菌數量的對數值之間的關聯曲線,在紅酵母50 CFU/mL到50×104CFU/mL的5個數量級之間獲得相關系數為0.9362的良好線性關系曲線(圖3a),回歸方程為Y=0.536X+34.462(Y代表系統檢測到的Cq值,X代表紅酵母數量的對數值)。在根霉菌2 850 CFU/mL到2 850×104CFU/mL的5個數量級之間獲得相關系數為0.9581的良好線性關系曲線(圖3b),回歸方程為Y=1.374X+29.722(Y代表系統檢測到的Cq值,X代表根霉菌數量的對數值)。10次重復檢測500CFU/mL紅酵母獲得的相對標準偏差為3.7%,10次重復檢測28 500 CFU/mL根霉菌獲得的相對標準偏差為3.2%,說明此體系對該類型真菌的檢測重復性較好。綜上所述,本研究所構建的熒光定量檢測體系,可在5 h完成酸奶樣品中真菌核酸的熒光定量檢測,獲得檢測Cq值后根據各自的關聯方程可推算出樣品中的真菌數量。

3 結論

本研究首先明確了空氣中能造成酸奶污染的真菌種類,紅酵母(Rhodotorula sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)是三種能在酸奶中生長的真菌種類,其中紅酵母最為常見,在實際的酸奶加工生產中應該重點預防。本研究的真菌分離鑒定結果對乳制品加工企業在真菌污染防治上提供了針對性參考。

在酸奶污染真菌的DNA快速檢測技術流程上,本研究首先解決了真菌破壁困難、乳品高蛋白背景的基因組抽提問題,并進一步比較了不同基因片段的PCR擴增效率,明確了適合酸奶污染真菌的最佳檢測DNA條形碼和條件,在此基礎上建立了初始檢測真菌數量與熒光信號值之間的關聯,形成了一套酸奶真菌DNA快速檢測體系。相比傳統培養檢測方法,本研究所形成的快速檢測體系,檢測流程縮短了檢測時間至5 h內,加快了酸奶的出廠時間,從而也延長了酸奶的貨架期。

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