氣相色譜-質譜聯用法測定葡萄酒中三種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精

陳丹萍,朱克衛,謝應新,楊富春

(1.佛山出入境檢驗檢疫局,廣東 佛山 528000；2.黃埔出入境檢驗檢疫局,廣東 廣州 510730)

葡萄酒作為上佳飲品,受到越來越多人的喜愛,它含有大量的生物活性物質［1］,對抗氧化、預防衰老、預防冠心病等有很好的作用［2-4］。葡萄酒的質量安全一直是人們關心的問題,但葡萄酒市場存在以次充好,甚至制假售假等非法行為［5］。出現劣質葡萄酒的原因主要有：一是劣質的葡萄原材料；二是葡萄酒在加工和包裝前為了節約成本加水稀釋,使葡萄酒口味變得平淡,于是個別生產企業就向葡萄酒中添加各種添加劑［6］(如合成著色劑、甜味劑、葡萄香精等),彌補葡萄酒的口感和香氣［7-8］。其中葡萄香精是一種食用香精,由2種或2種以上的香料和助劑按一定的比例制成的葡萄味的香料混合物。葡萄香精的主要成分是鄰氨基苯甲酸酯類,其中包括鄰氨基苯甲酸甲酯、N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸乙酯,然后再輔以酒香、玫瑰花香、糖甜香,配以酯類果香而成［9-10］。據資料報道,鄰氨基苯甲酸酯類一般存在于甜橙、檸檬、葡萄等水果的芳香組分中,葡萄酒中只有美洲葡萄及其雜交品種釀制的葡萄酒才含有鄰氨基苯甲酸酯類,而歐洲葡萄品種未見有關鄰氨基苯甲酸酯類的報道［12-13］。

國家標準GB 15037—2006《葡萄酒》中明確規定葡萄酒中不得添加任何香精,否則被視為不合格產品［11］。但我國暫沒有葡萄酒中鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精檢測的相關標準方法。因此,有必要對葡萄酒中鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精進行檢測分析。

氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法在食品分析中迅速發展［14-16］,保證了質譜分析結果的穩定性和準確性。本研究建立了簡單、快捷、準確的葡萄酒中鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的檢測方法,為辨別葡萄酒的真假提供了有力的手段,有助于有關部門對葡萄酒進行更加全面的監管,保障食品的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用葡萄酒：市售。乙醇、正己烷(均為色譜純)：德國默克公司；氯化鈉(分析純)：廣州化學試劑廠；C18吸附劑、N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)吸附劑：安捷倫科技有限公司；鄰氨基苯甲酸甲酯(純度≥99%)、N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯(純度≥98%)、鄰氨基苯甲酸乙酯(純度≥99%)：美國Alfa Aesar公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；HY-BⅡ渦旋振蕩器：上海琪特分析儀器有限公司；QT-1回旋振蕩器：江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確量取10.0 mL葡萄酒樣品于50 mL離心管中(起泡葡萄酒常溫超聲30 min脫氣后再取樣),用10 mL正己烷進行提取,渦旋2 min,再置入振蕩器中振搖10 min,充分混勻后以4 000 r/min離心5 min,吸取上層有機層于另一離心管中(若分層不明顯,則加入少量氯化鈉,使其下層飽和),再重復提取一次,合并上清液,于水浴溫度40℃條件下在氮吹儀上氮吹,濃縮至＜0.5 mL,用無水乙醇溶解殘渣并定容至1.0 mL,過0.2μm微孔濾膜,供上機分析。

1.3.2 氣質聯用法分析條件

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)。程序升溫：初始溫度70℃,以5℃/min升至160℃,再以20℃/min升至260℃,后運行280℃。進樣口溫度280℃,輔助通道溫度280℃,氦氣流速1 mL/min,進樣量1μL,進樣方式：不分流進樣。

質譜條件：離子源溫度230℃,四極桿溫度150℃,電離方式為電子電離(electronic ionization,EI)源,質譜掃描方式為選擇離子監測(selectionmoniring,SIM),定量離子、定性離子及豐度比分別為鄰氨基苯甲酸甲酯離子：119(100)：151(61)：92(59)：65(33)、N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯離子：165(100)：105(93)：104(88)：77(64)、鄰氨基苯甲酸乙酯離子：119(100)：165(52)：92(44)：120(34)。

1.3.3 標準溶液的配制

單標儲備液配制：分別準確稱取3種標準品鄰氨基苯甲酸甲酯、N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸乙酯10 mg(于3個100 mL容量瓶中,用乙醇溶解并定容至刻度,配制成100 mg/L的標準儲備液,儲存于-18℃冰箱中備用。

混合標準儲備液配制：各取1.0mL上述標準儲備液,用乙醇定容至10 mL,配制成10 mg/L的混合標準儲備液。

混合標準工作液配制：將上述混合標準儲備液用乙醇稀釋成0.05mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.00mg/L混合標準系列溶液,現用現配。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

葡萄酒基本成分有水、醇、糖、酸、單寧、多酚,還含有豐富的氨基酸、維生素C、礦物質及多種微量香味成分,其中水作為溶劑占主要體積,屬于極性溶劑；鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精屬于弱極性溶質,因此選用非極性或弱極性的有機溶劑才能對葡萄酒樣品中的鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精進行提取。一般實驗室可選擇的非極性、弱極性有機溶劑有二氯甲烷、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙醚、苯、甲苯等。苯和甲苯毒性較強,考慮到實驗人員安全和對環境的影響,本實驗暫不考慮將其作為提取溶劑；二氯甲烷密度大,萃取后有機層在下層,吸取有機層進行濃縮時操作不便,誤差較大,因此不考慮二氯甲烷作為提取溶劑；乙醚、乙酸乙酯萃取葡萄酒時,提取葡萄香精的同時還提取了少量的色素,需考慮進一步凈化有機層的步驟,將前處理復雜化,因此也不考慮乙醚、乙酸乙酯作為提取溶劑；石油醚、正己烷作為提取溶劑具有操作簡便,分層明顯,提取效果好等特點。以干紅葡萄酒為樣品基質,石油醚、正己烷作為提取溶劑,分別進行不同加標水平的回收實驗,結果見圖1。由圖1可知,兩種提取溶劑都具有良好的回收率,正己烷提取的整體回收率比石油醚的要高。因此,最終選用正己烷作為本實驗的提取溶劑。

圖1 兩種提取溶劑對干紅葡萄酒中鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精不同加標水平提取效率的影響Fig.1 Effects of two extraction solvents on the extraction efficiency of anthranilates grape essence at different spiked levels in dry red wine

2.2 凈化方式的選擇

本次實驗對于液-液萃取凈化方式和分散固相萃取結合液-液萃取凈化方式進行了比較,液-液萃取凈化方式是在液-液萃取濃縮定容后不再凈化,直接上機。而分散固相萃取結合液-液萃取凈化方式是在液-液萃取濃縮定容后再加入無水硫酸鎂、C18和PSA進行凈化,凈化后再上機。

加入無水硫酸鎂、C18和PSA的量分為兩組,一組為0.2 g無水硫酸鎂、0.1 g C18、0.1 g PSA；另一組各質量減半,為0.1 g無水硫酸鎂、0.05 g C18、0.05 g PSA,選用有代表性的干紅葡萄酒作為樣品,進行分散固相萃取加標回收測試。

結果表明,加入分散固相萃取凈化劑后回收率時高時低,加入凈化劑的量也會影響回收率,特別是鄰氨基苯甲酸甲酯,加入凈化劑量較大會導致回收率偏高。對比分散固相萃取前后選擇離子色譜圖,樣品的背景沒有明顯的改變。而液-液萃取比分散固相萃取更加簡便、經濟,不經過分散固相萃取也能得到很好的色譜圖,且回收率符合要求,所以本實驗的凈化方式選擇液-液萃取。

2.3 色譜條件的優化

圖2 三種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精混標(A)及加標樣品(B)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of three O-aminobenzoic acid esters grape essence mixed standard(A)and adding standard samples(B)

鄰氨基苯甲酸酯類3種葡萄香精屬于弱極性化合物,通過對2種相同規格不同極性的色譜柱DB-17MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)和HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)的對比使用,最終選用固定相為5%苯基-甲基聚硅氧烷的HP-5MS石英毛細管柱。

調整程序升溫的升溫速率和保持時間,最終選擇了初始柱溫70℃,以5℃/min升至160℃,再以20℃/min升至260℃,后運行280℃進行GC分離。

流速分別選擇了0.5 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min進行測試,其中1.0 mL/min能使三個目標峰完全分開,響應值較高,分離度最好,峰形尖銳且對稱。

2.4 三種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的測定

三種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精混標及加標樣品氣相色譜質譜圖見圖2。

由圖2可知,鄰氨基苯甲酸甲酯出峰時間為12.359min；N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯出峰時間為14.028min；鄰氨基苯甲酸乙酯出峰時間為14.177 min。在最佳色譜條件下,3種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精能夠較好地分離。

2.5 質譜條件的優化

首先采用單一標準品進樣,在全掃描模式下,分別獲得3種葡萄香精的總離子流色譜圖,確定目標物的保留時間,扣除本底后,根據對全掃描質譜圖的分析,確定目標物的特征離子及離子間的比值。

3種葡萄香精分子質量分別為151.06(鄰氨基苯甲酸甲酯)、165.08(N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯)、165.08(鄰氨基苯甲酸乙酯),對上述全掃描質譜圖碎片離子進行分析,考慮到碎片離子的特異性、排除基質雜質離子干擾、定性定量離子的數量等因素,本實驗選用4個特征離子進行定性,其中一個響應值最高離子進行定量,如表1所示。

根據優化好的質譜條件及定性定量離子,采用選擇離子監測(SIM)掃描模式,進一步提高靈敏度,改善峰形和精密度,滿足痕量分析的要求。

表1 三種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的保留時間、定量離子、定性離子Table 1 Retention time,quantitative ions and qualitative ions of three O-aminobenzoic acid esters grape essence

2.6 線性范圍和方法定量限

將配制的混合標準系列溶液0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L進行氣相色譜-質譜分析,以標準工作溶液中各葡萄香精的濃度為橫坐標,定量離子提取色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線,得到線性方程結果見表2。由表2可知,3種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精在0.05～1.00 mg/L范圍內,呈現良好的線性關系(相關系數R2值均＞0.998)。在空白樣品中添加低濃度的混合標準工作溶液,進行前處理后上機檢測,按10倍信噪比得到3種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的方法定量限均為5μg/L。

表2 三種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的線性方程、相關系數及方法定量限Table 2 Regression equation,correlation coefficients and method limits of quantification(LOQs)of three O-aminobenzoic acid esters grape essence

2.7 加標回收率和精密度

以干紅葡萄酒空白樣品加標方法進行準確度和精密度實驗,添加水平為5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L,每個水平重復測定6次,結果見表3。由表3可知,3種香精的平均回收率分別為90.3%～99.3%、86.2%～102.4%、90.8%～101.1%；精密度試驗結果相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)分別為1.02%～8.75%、1.44%～7.55%、2.33%～6.56%,該方法精密度良好,準確性可靠。

表3 3種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的加標回收率和精密度實驗結果Table 3 Results of adding recoveries rate and precision experiments of three O-aminobenzoic acid esters grape essence

2.8 實際樣品的測定

收集312個葡萄酒樣品作為研究對象,依次編號為#001、#002、……、#312。樣品包含了不同色澤(紅葡萄酒、白葡萄酒、桃紅葡萄酒),不同含糖量(干葡萄酒、半干葡萄酒、半甜葡萄酒、甜葡萄酒),不同二氧化碳含量(平靜葡萄酒和起泡葡萄酒),不同國家(包括新世界葡萄酒和舊世界葡萄酒,具體國家有中國、西班牙、意大利、葡萄牙、法國、德國、澳大利亞、新西蘭、美國、智利、阿根廷、南非),樣品具有一定的代表性。

在312個葡萄酒樣品中,被檢出鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的有13個,占總樣品數的4.2%,其中,檢出鄰氨基苯甲酸甲酯有5個,含量分別為31.07μg/L、35.35μg/L、7.03μg/L、210μg/L、6.02μg/L,檢出鄰氨基苯甲酸乙酯有8個,含量分別為5.47μg/L、7.77μg/L、5.37μg/L、5.10μg/L、7.20μg/L、5.18μg/L、7.17μg/L、5.25μg/L,檢出N-甲基鄰氨基苯甲酸甲酯,出峰時間為12.359 min,含量為6.05μg/L。實際樣品中檢出鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的原因可能是：美洲葡萄及其雜交品種釀制的葡萄酒含有鄰氨基苯甲酸酯類；不法商家以次充好而違法添加了鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精。

3 結論

本研究建立了氣相色譜-質譜聯用法測定葡萄酒中鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的檢測方法。結果表明,該方法定量限為5μg/L,3種鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精在0.05～1.00 mg/L范圍內呈現良好的線性關系,相關系數R2值均＞0.998,樣品加標平均回收率為86.2%～102.4%,精密度試驗結果相對標準偏差為1.02%～8.75%。該方法簡便、快速、準確、靈敏,具有良好的精密度及準確性,可用于葡萄酒中鄰氨基苯甲酸酯類葡萄香精的測定。

參考文獻：

［1］陳達煒,呂 冰,丁 顥,等.超高效液相色譜-同位素稀釋高分辨質譜法測定紅葡萄酒中的18種農藥殘留［J］.色譜,2014,32(5)：485-492.

［2］楊 晶,朱圣陶,周 莉,等.干紅葡萄酒營養質量指標研究［J］.食品工業科技,2012,33(18)：355-358.

［3］王衛國,胡曉偉.葡萄酒中多酚及多酚氧化酶研究現狀與展望［J］.中國釀造,2017,36(8)：16-19.

［4］邵志芳.葡萄酒品質分析研究進展［J］.中國釀造,2015,34(4)：43-46.

［5］馮 峰,楊 爍,凌 云,等.超高效液相色譜-串聯質譜快速篩查葡萄酒中的14種禁用食品添加劑［J］.分析化學,2011,39(11)：1732-1737.

［6］郝鵬飛,徐 琴,牟志春,等.氣相色譜-質譜法同時測定葡萄酒中13種防腐劑［J］.分析試驗室,2013,32(7)：108-111.

［7］劉晶晶.進口葡萄酒質量問題紅燈頻現［J］.中國食品,2015(7)：62-65.

［8］崔曉輝,賀麗娜.進口葡萄酒問題突出需重視［J］.中國檢驗檢疫,2013(4)：29-30.

［9］周耀華,肖 兵.食用香精制備技術［M］.北京：中國紡織出版社,2007：51.

［10］孫寶國.食用調香術［M］.第 2 版.北京：化學工業出版社,2010：36.

［11］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB 15037—2006葡萄酒［S］.北京：中國標準出版社,2008.

［12］張明霞,吳玉文,段長青.葡萄與葡萄酒香氣物質研究進展［J］.中國農業科學,2008,41(7)：2098-2104.

［13］劉麗媛,劉延琳,李 華.葡萄酒香氣化學研究進展［J］.食品科學,2011,32(5)：310-314.

［14］應全紅,王 霓,白德奎,等.白酒中塑化劑GC-MS檢測方法的研究［J］.中國釀造,2013,32(11)：136-138.

［15］王 東,侯傳金,趙爾成,等.分散液液微萃取/氣相色譜-質譜法測定蜂蜜中六六六和滴滴涕類農藥殘留［J］.色譜,2015,33(1)：40-45.

［16］周 雪,曹淑瑞,李賢良,等.氣相色譜-質譜法快速檢測出口蔬菜中16 種保鮮劑殘留［J］.分析化學,2015,43(1)：87-92.