不同釀酒高粱酚類物質含量測定及抗氧化活性比較

田新惠,唐玉明,任道群,姚萬春,劉茂柯,張星宇

(1.四川省農業科學院 水稻高粱研究所生物中心,四川 德陽 618000；2.瀘州市釀酒科學研究所,四川 瀘州 646100)

高粱是世界五大作物之一［1］,在我國種植面積廣泛,主要用于釀酒、釀醋以及工業原料等［2］。高粱是白酒的主要釀造原料,俗話說“好酒離不開紅糧”說明原料對白酒品質的重要性［3］。高粱籽粒中富含多酚類化合物、原花青素、黃酮類化合物、單寧酸等具有很強的抗氧化成分［4］。有研究發現,富含多酚的高粱品種釀造的白酒口感綿甜,回味悠長,是優質白酒釀造原料［5-6］。

高粱籽粒中多酚類物質豐富,其含量在不同地區與品種間的差異較大［7-8］。優質白酒多選用四川糯紅高粱,結合特殊的釀造工藝進行釀造而成。目前從白酒中已檢測出多種對人體有益的功能性成分［9］,包括低分子有機酸、酯類、雜環類等多酚類物質成分,如阿魏酸等具有健康保健功效［10］。釀造原料中的酚酸類物質也是白酒中風味物質形成的前體物質。

目前,對于釀酒高粱的研究,僅限于優良品種的培育,而對釀酒高粱籽粒中多酚類化合物的研究較少。因此,本實驗從釀造原料“紅糧”入手,以企業推廣應用的釀酒高粱為研究對象,研究不同品種釀酒高粱籽粒中游離態與結合態酚類物質的組成及含量,并進行抗氧化活性分析,為篩選優質專用釀造品種提供理論支持,以期為優化釀造工藝以及健康白酒有益成分來源的形成提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用釀酒高粱品種見表1,2016年收獲成熟新籽粒,曬干,4℃保存備用。

沒食子酸(純度≥97.9%)、原兒茶酸(純度≥98.9%)、龍膽酸(純度≥99.5%)、咖啡酸(純度≥99.0%)、香草酸(純度≥98.2%)、丁香酸(純度≥98.0%)、香豆酸(純度≥98.0%)、阿魏酸(純度≥99.3%)、水溶性維生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid,Trolox)(純度≥98.0%)、三吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine,TPTZ)(純度≥98.0%)、福林酚(色譜純)：美國Sigma公司；蘆丁(純度≥98%)：索萊寶生物有限公司；無水甲醇、碳酸鈉、亞硝酸、過硫酸鉀、六水氯化鋁、乙酸乙酯(均為分析純)：恒泰力天生物有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮科技有限公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀：德國賽默飛公司；U-3010型紫外可見分光光度計：日本Hitachi公司；CT410旋風式樣品磨：福斯賽諾分析儀器有限公司；RE-52旋轉蒸發器：上海亞榮系列儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒高粱籽粒樣品的制備

分別稱取100 g不同品種的高粱籽粒,粉碎,過80目篩后,于-20℃保存。

1.3.2 釀酒高粱籽粒中水分含量的測定［11］

采用差減法測定水分含量,每個試驗重復3次。

1.3.3 釀酒高粱籽粒中游離態酚類物質的提取

參照TIH等［12］的方法稍有改動：稱取釀酒高粱籽粒樣品1 g,加入15 mL溫度為4℃的酸化甲醇(體積分數95%甲醇∶1 mol/LHCl=85∶15,V/V)于4℃條件下振蕩提取10 min,3 500×g離心10 min,取上清液,重復提取3次后,合并上清液,于45℃旋轉蒸發至無水狀態,用體積分數為80%的甲醇溶解并定容至10 mL,于-20℃保存,待測。

1.3.4 釀酒高粱籽粒中結合態酚類物質的提取

參照SHENGER等［13］的方法提取高粱籽粒中結合態酚類物質：向提取游離酚后的沉淀物中,加入20 mL 2 mol/L NaOH,在氮氣保護下攪拌1 h后,用HCl(6 mol/L)調節水解液的pH值至1.5～2.0,添加80 mL正己烷振蕩除脂類物質,加入40 mL乙酸乙酯,靜置15 min,3 000×g離心15 min,重復提取5次后,合并提取液,于45℃旋轉蒸發至干,采用體積分數為80%的甲醇溶解并定容至10 mL,于-20℃保存。

1.3.5 釀酒高粱籽粒中總酚含量的測定［14］

樣品中總酚含量的測定：以沒食子酸(gallic acid,GA)標準品溶液質量濃度(x)為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程：y=23.54x+0.043,相關系數R2=0.999 3。按照沒食子酸標準曲線回歸方程計算樣品中總酚的含量,結果以沒食子酸當量(gallic acid equivalent,GAE)表示mg GAE/100 g。

1.3.6 釀酒高粱籽粒中總黃酮含量的測定［15］

樣品中總黃酮含量的測定：以蘆丁標準品溶液質量濃度(x)為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程：y=0.003 1x+0.004 4,相關系數R2=0.999 6,依據標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮的含量,結果以mg/100 g表示。

1.3.7 高效液相色譜法測定酚酸物質的含量［16］

采用高效液相色譜(highperformanceliquid chromatography,HPLC)法測定釀酒高粱籽粒中單體酚酸物質的含量,HPLC檢測條件：SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；檢測波長280 nm；柱溫為40℃；進樣量為10μL；流動相A(2%甲酸)和流動相B(乙腈),梯度洗脫條件：0～30 min,A 95%～75%,B 5%～25%；30～50min,A 60%,B 40%；50～60 min,A 95%,B 5%,后運行5 min,總運行時間65 min；流速為0.80 mL/min。

標準曲線的繪制：將酚類化合物的標準品(沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸)系列溶液,按照高效液相色譜法測定并制定標準曲線,每種酚類化合物的含量測定結果用μg/g表示。

1.3.8 抗氧化活性分析［17-18］

(1)釀酒高粱籽粒樣品鐵離子還原力測定

根據參考文獻稍作相應修改：制備鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidantpower,FRAP)試劑,取20μL高粱籽粒游離酚、結合酚提取液,加入260μL FRAP試劑,充分混勻避光反應20 min,然后在波長593 nm處測定吸光度值。以不同濃度(x)Trolox標準品溶液為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程：y=0.002 0x-0.036 1,相關系數R2=0.999 8,按照Trolox的標準曲線回歸方程,計算樣品的FRAP值,結果以μmol/g表示。

(2)釀酒高粱籽粒樣品自由基清除能力測定［18］

2,2‘-連氮-二(3乙基苯并咪唑啉-6磺酸)(2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)自由基清除能力測定：用無水甲醇調節ABTS母液的濃度,使其在波長734 nm處的吸光度值為0.70±0.02,將其作為ABTS自由基工作液。4.9mL ABTS自由基工作液與0.1mL高粱籽粒提取液混合,靜置,室溫條件下反應10 min后立即在波長734 nm處測定吸光度值,以無水甲醇作空白,按照Trolox的標準曲線回歸方程,計算樣品的ABTS自由基清除能力,采用Trolox當量(Trolox equivalent,TE)表示某種抗氧化劑相當于Trolox的濃度(mmol/L),結果以μmol TE/g表示。

1.3.9 數據分析

采用SPSS16.0、Excel2013軟件進行數據分析,重復3次,數值以均值加標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同品種釀酒高粱籽粒的總酚含量

不同品種釀酒高粱籽粒中游離態和結合態總酚含量測定結果見圖1。由圖1可知,不同品種釀酒高粱籽粒結合態總酚存在顯著性差異(P＜0.05),其中,國窖紅高粱籽粒結合態總酚含量最高為1 383.08 mg GAE/100 g,內蒙高粱總酚含量最低為618.2 mg GAE/100 g。而游離態總酚含量之間差異較小,其中,瀘糯8號來源的高粱籽粒含量最高為274.38 mg GAE/100 g。結合態總酚含量高于游離態總酚含量,表明釀酒高粱籽粒中總酚以結合態為主。

圖1 不同品種釀酒高粱籽粒中總酚含量測定結果Fig.1 Determination results of total phenolic contents in different varieties of liquor-making sorghum

2.2 不同釀酒高粱品種的總黃酮含量

不同品種釀酒高粱籽粒游離態和結合態總黃酮含量測定結果如圖2所示。由圖2可知,不同品種釀酒高粱籽粒中的結合態總黃酮含量均高于游離態總黃酮含量。青殼洋、國窖紅、瀘糯8號高粱品種的結合態總黃酮含量(434.84mg/100g、303.39mg/100g、267.58mg/100g)明顯高于遼寧、山西、內蒙高粱品種(123.06mg/100g、162.90mg/100g、175.48mg/100g),且結合態黃酮含量品種間差異顯著(P＜0.05)。不同品種釀酒高粱籽粒間的游離態黃酮含量差異較小,表明釀酒高粱籽粒中的黃酮類物質主要以結合態形式存在。

圖2 不同品種釀酒高粱籽粒中總黃酮含量測定結果Fig.2 Determination results of total flavonoids contents in different varieties of liquor-making sorghum

2.3 不同釀酒高粱籽粒中酚酸物質含量

采用高效液相色譜法測定不同釀酒高粱籽粒中游離型與結合型酚酸物質含量。7種混合標準品液相色譜圖如圖3所示。由于龍膽酸檢測波長為320 nm,故而未在混標之內,采用單標測定。

圖3 標準混合標樣HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed standard sample

不同品種釀酒高粱籽粒中游離態與結合態酚類物質組成及含量測定結果見表2。由表2可知,不同品種釀酒高粱籽粒中的游離態和結合態的酚類物質組成基本相同,但品種間各酚酸物質含量差異顯著(P＜0.05)。釀酒高粱籽粒中香豆酸、咖啡酸、香草酸、原兒茶酸、丁香酸、阿魏酸均以游離態與結合態形式存在,而沒食子酸僅以游離態形式存在,龍膽酸在檢測樣品中均未檢出。釀酒高粱籽粒中游離態酚酸主要以阿魏酸、丁香酸與沒食子酸為主,三者約分別占游離態總酚酸的39.6%、24.6%及23.3%,平均含量分別為611.19μg/g、380.66μg/g、359.34μg/g。結合態酚酸含量主要以阿魏酸、丁香酸為主,其含量分別占結合態總酚酸的72.69%、17.03%,平均含量分別為1 608.33μg/g、376.78μg/g。

表2 不同品種釀酒高粱籽粒中酚酸物質含量測定結果Table 2 Determination results of phenolic acids contents in different varieties of liquor-making sorghum μg/g

2.4 不同品種釀酒高粱籽粒的鐵離子還原能力

不同品種釀酒高粱籽粒的游離態與結合態物質的鐵離子還原能力如表3所示。由表3可知,釀酒高粱籽粒中游離態鐵離子還原能力值在5.92～7.46μmol/g范圍內。結合態抗氧化能力值在29.37～55.34μmol/g范圍內,且結合態多酚的抗氧化能力為游離態的抗氧化能力的5～8倍,其中結合態抗氧化能力占總抗氧化能力的85.7%。6種釀酒高粱品種的總抗氧化能力順序依次為瀘糯8號＞青殼洋＞國窖紅＞內蒙高粱＞山西高粱＞遼寧高粱,四川釀酒高粱籽粒中總抗氧化能力高于其他地區釀酒高粱籽粒。

表3 不同釀酒高粱品種的FRAP值Table 3 FRAP value of different varieties of liquor-making sorghum

2.5 不同品種釀酒高粱籽粒的ABTS自由基清除能力

不同品種釀酒高粱籽粒的游離態與結合態物質的ABTS自由基清除能力如表4所示。由表4可知,釀酒高粱籽粒中游離態ABTS自由基清除能力在5.49～7.43μmol TE/g范圍內；結合態ABTS自由基清除能力在30.79～47.84μmol TE/g范圍內。結合態為游離態ABTS自由基清除能力的6倍,品種間差異顯著(P＜0.05)。釀酒高粱籽粒結合態ABTS自由基清除能力占總ABTS自由基清除能力的85.4%。6種釀酒高粱品種ABTS自由基清除能力順序依次為瀘糯8號＞青殼洋＞國窖紅＞內蒙高粱＞山西高粱＞遼寧高粱,且四川釀酒高粱籽粒中抗氧化能力高于其他地區釀酒高粱品種。

表4 不同釀酒高粱品種的ABTS自由基清除Table 4 ABTS free radical scavenging of different varieties of liquor-making sorghum

3 結論

(1)六種釀酒高粱籽粒中總酚、總黃酮以及8種酚酸總和的含量范圍分別為799.45～1630.58 mg/100 g,228.30～583.15 mg/100 g,238.9～492.6 mg/100 g,即總酚含量＞總酚酸含量＞總黃酮含量。高粱糠中總酚含量為1 127.49 mg GAE/100 g［19］,這與釀酒高粱籽粒中總酚含量相接近,表明高粱籽粒中多酚物質集中于表皮［20］。與其他谷物相比,釀酒高粱籽粒中總酚、總黃酮含量高約為糙米總酚的5～8倍,糙米黃酮的4倍左右［21］。

(2)抗氧化活性檢測方法基于以下機理：在特定條件下,檢測體系中自由基的清除能力與樣品的還原能力反映被測物的抗氧化活性。FRAP鐵離子還原能力,樣品的還原力越強,抗氧化能力越強。ABTS抗氧化能力,由過硫酸銨氧化作用產生的單陽離子自由基,可與任何羥基化的芳香族化合物反應,與實際抗氧化能力有關［22］,這兩種方法均能良好的反映高粱籽粒中抗氧化活性。通過測定釀酒高粱籽粒中游離型與結合型酚類化合物都具有較強抗氧化能力［23］。

(3)不同存在形態的酚類物質對不同體系抗氧化作用存在差異,與酚類物質相對含量、存在形態以及鍵合方式有關［24］。本研究中釀酒高粱籽粒中,結合酚類物質的抗氧化活性占總抗氧化活性85%以上,這與結合型酚類物質含量遠高于游離型酚類物質含量成正相關。結合型酚類物質如何影響其抗氧化能力還需進一步的研究。鑒于釀酒高粱籽粒中含有豐富的多酚類物質與良好的抗氧化活性,可進一步研究發酵過程中多酚等小分子物質變化對發酵風味物質形成的作用［25］。

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