氣相色譜法測定金銀花露中芳樟醇含量

馬 力,張楓源,向 福,2*,丁蘭草,吳 慧,何 峰,2

(1.經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室,湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心,湖北 黃岡 438000)

金銀花(Lonicera japonica),也稱忍冬,藥食兩用的名貴中藥材,用藥歷史悠久,具有清熱解毒、疏風散熱、活血化瘀之功效［1-3］,其綠原酸、木犀草素、芳樟醇等藥用成分對多種疾病有良好的預防和治療效果［2,4］,是養生保健佳品,廣泛用于食品行業［5］。大別山地區金銀花資源豐富,“羅田金銀花”香氣濃郁、揮發油含量高,2011年獲批中國地理標志產品,推動了地方以金銀花露加工為代表的金銀花產業發展。

金銀花露是一種傳統的消暑解熱飲品［6］,由金銀花用水蒸氣蒸餾提取其揮發性成分制得,為無色至淡黃色的透明液體,味微甜,氣芳香,清熱解毒、散熱疏風［1,7］。芳樟醇是天然揮發油中分布最重要和最廣泛的萜烯香料之一,有百合花或鈴蘭花香,是金銀花發揮藥理作用的主要揮發性成分［6,8-9］,不僅抗菌活性明顯［10-12］,同時具有抗炎、抗焦慮、鎮靜催眠等保健醫療作用［13-16］,因此中國藥典2015版將其作為金銀花露產品質量規范控制的指標性成分,但并無其含量測定項［7,17］。

目前大別山地區金銀花露產品較多,但質量參差不齊,產品中芳樟醇含量等指標有待進一步規范。近年來,金銀花露產品質量逐漸引起人們關注,但產品中芳樟醇含量的報道僅限于兩家企業的3批金銀花露樣品和一種自制山銀花露樣品［17-18］,缺乏代表性。因此,本研究根據中國藥典2015版建立了測定芳樟醇含量的氣相色譜法,并利用該方法測定了5個廠家市售不同批次的24種金銀花露產品中芳樟醇含量,旨在為金銀花露產品的質量控制提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅田金銀花干花原料：由湖北楚天舒藥業有限公司提供；乙酸乙酯、正辛醇(均為分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；芳樟醇對照品(CAS：78-70-6)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；A和B兩家企業的金銀花露不同批次樣品購于當地藥店和超市,C、D、E三家企業的金銀花露不同批次樣品由企業提供,共52個樣品。

1.2 儀器與設備

Agilent GC7890A氣相色譜儀配火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID)：美國安捷倫科技公司；FA2104電子分析天平：上海精細天平有限公司；DZTW調溫電熱套：北京市永光明醫藥儀器有限公司；玻璃標準口油水分離器：科學教研玻璃儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品溶液制備

(1)內標物溶液的配制

精密量取0.5mL正辛醇至50mL容量瓶,用乙酸乙酯定容混勻后,取出1 mL溶液置于100 mL容量瓶,用乙酸乙酯定容,混勻,制得質量濃度83.0μg/mL的內標物溶液,備用。

(2)芳樟醇對照液的配制

精密量取0.6mL芳樟醇于25mL容量瓶,用乙酸乙酯定容混勻后,取出1 mL于100 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,混勻,制得質量濃度202.51μg/mL的芳樟醇溶液,取該溶液1 mL于10 mL容量瓶,乙酸乙酯定容,搖勻制得質量濃度為20.3μg/mL的芳樟醇對照液,備用。

(3)金銀花露及金銀花供試液的制備

按照《中國藥典》2015年版的鑒別方法［7］,取金銀花露飲料100 mL,置于圓底燒瓶,加氯化鈉20 g和適量沸石,連接油水分離器,自分離器上端加水至刻度部分,并溢流入燒瓶為止,再加入乙酸乙酯2～5 mL,電熱套加熱至沸騰,保持微沸2 h,放冷后吸出乙酸乙酯層,并加入適量無水硫酸鈉脫水,靜置分層后,吸取上清液置于10 mL容量瓶,加入0.5 mL內標物(正辛醇)溶液,乙酸乙酯定容,搖勻即為金銀花露供試液,備用。

稱取干金銀花樣品10g置于圓底燒瓶,加氯化鈉20g,連接油水分離器,按上述操作,脫水后吸取上清液置于10mL容量瓶,加入0.5 mL內標物(正辛醇)溶液,乙酸乙酯定容,搖勻即為金銀花供試液,備用。

1.3.2 氣相色譜法檢測

對芳樟醇對照液和供試液采用氣相色譜分析,所得結果用內標法計算樣品中芳樟醇的含量。氣相色譜條件：Agilent HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；程序升溫：初始溫度為70℃,保持1 min,以3℃/min的速率升溫至130℃,再以50℃/min的速率升溫到250℃,維持8 min；汽化室溫度：260 ℃；載氣：氮氣(N2),柱流速：3 mL/min；進樣量1.0 μL；分流比為1∶1。

1.3.3 方法驗證

(1)最小檢出限濃度試驗

精密量取芳樟醇對照液0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL,分別加入10 mL容量瓶,各精密加入內標物溶液0.5 mL,用乙酸乙酯稀釋定容,制得芳樟醇質量濃度分別為0.04μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.41μg/mL的對照品溶液。按照1.3.2節條件進行氣相色譜法分析,對比內標物正辛醇和芳樟醇的出峰情況和保留時間。

(2)線性關系試驗

精密量取芳樟醇對照液0.05 mL、0.10 mL、1.00 mL、2.00 mL和5.00 mL,分別加入10 mL容量瓶,各精密量加入內標物溶液0.50 mL,用乙酸乙酯稀釋定容,制備系列濃度的對照品溶液。按照1.3.2節條件進行氣相色譜法分析,記錄峰面積。

(3)精密度試驗

取芳樟醇対照液5.0 mL,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL內標物溶液,用乙酸乙酯稀釋定容。按照1.3.2節條件進行氣相色譜法分析,重復進樣6次,記錄內標物和芳樟醇峰面積。

(4)重復性試驗

精密量取芳樟醇対照液1.5 mL,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL內標物溶液,用乙酸乙酯稀釋定容,平行制備7份。按照1.3.2節條件進行氣相色譜法分析,記錄內標物和芳樟醇峰面積。

(5)穩定性試驗

精密量取2 mL芳樟醇對照液,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL內標物溶液,用乙酸乙酯稀釋定容,分別在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h時間區段按照1.3.2節條件進行氣相色譜法分析,記錄內標物和芳樟醇峰面積。

(6)加樣回收率試驗

精密量取已知芳樟醇質量濃度(17.64μg/100mL)的金銀花露飲料樣品100mL,加入1mL芳樟醇對照液(20.3μg/mL),混勻,平行制備7份。按照1.3.1節方法提取制備供試液,并按1.3.2節條件進行氣相色譜法分析,記錄內標物和芳樟醇峰面積,計算加樣回收率。

1.3.4 樣品芳樟醇含量測定

取不同批次的52個金銀花露樣品(樣品制備3個平行樣,少數產品由于樣品量不足,制備2個平行樣或無平行樣)和干金銀花樣品,按照1.3.1節方法提取制備供試液,并按1.3.2節條件進行氣相色譜法分析,記錄內標物和芳樟醇峰面積,根據線性回歸方程計算樣品的芳樟醇含量。

1.3.5 統計分析

利用EXCEL 2003和SPSS22等軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 方法驗證

2.1.1 最小檢出限濃度

根據圖1所示氣相色譜圖,芳樟醇質量濃度為0.04μg/mL時,內標物正辛醇獨立出峰,保留時間為5.423 min,對照品芳樟醇無信號；質量濃度0.10μg/mL時,內標物和對照品均獨立出峰,且正辛醇和芳樟醇保留時間分別為5.422 min和6.175 min,分離度大于2。因此,本試驗中芳樟醇最小檢出限為0.10μg/mL。

圖1 不同質量濃度芳樟醇的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of linalool with different concentration

2.1.2 線性關系

確定線性關系的最低濃度不低于最小檢出限,并以對照品芳樟醇與內標物正辛醇的質量濃度比(x)為橫坐標,峰面積比(y)為縱坐標,擬合標準曲線(見圖2),得線性回歸方程為y=0.7004x-0.0089,相關系數R2=0.999 4,表明芳樟醇含量在0.1013～10.125 0μg/mL范圍內線性關系良好。

圖2 芳樟醇標準曲線Fig.2 Standard curve of linalool

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗

同一質量濃度的芳樟醇對照液重復進樣6次,測定芳樟醇峰面積和內標物正辛醇的峰面積,結果如表1所示。由表1可知,芳樟醇與內標物峰面積比值的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為1.05%,表明該方法儀器的精密度良好。

表1 精密度試驗結果Table 1 Results of precision tests

2.2.2 重復性試驗

平行制備同一濃度的芳樟醇對照液7份,測定芳樟醇峰面積和內標物正辛醇的峰面積,結果如表2所示。由表2可知,芳樟醇與內標物峰面積比值的RSD為0.65%＜2.0%,表明該方法重復性良好。

表2 重復性試驗結果Table 2 Results of repeatability tests

2.2.3 穩定性試驗

供試液配制后不同時間進樣,測試穩定性,結果如表3所示。由表3可知,芳樟醇與內標物正辛醇的峰面積比值RSD=1.20%＜2.00%,表明樣品溶液在12 h內穩定,表明該方法穩定性良好。

表3 穩定性試驗結果Table 3 Results of stability tests

2.2.4 加樣回收率試驗

平行制備已知芳樟醇質量濃度(17.64μg/100 mL)的金銀花露樣品7份,精密加入1mL芳樟醇對照液(20.3μg/mL),加樣回收率計算結果如表4所示。由表4可知,芳樟醇的平均回收率為100.27%(n=7),RSD為1.62%＜2.0%,表明本試驗方法準確可靠。

表4 加樣回收率試驗結果(n=7)Table 4 Results of adding sample recovery rate test

2.3 樣品芳樟醇含量測定

內標法計算24種金銀花露產品共52個批號樣品中芳樟醇含量結果見表5。由表5可知,A、B、C三家生產企業的16種產品共35個樣品均檢測到芳樟醇,D、E兩家生產企業的8種產品共17個批號樣品未檢出芳樟醇信號,其芳樟醇含量可能低于本方法的最小檢出限為0.10μg/mL。

檢測出芳樟醇信號的16種金銀花露產品含量比較如圖3所示。由表5和圖3可知,芳樟醇含量最高和最低的產品均來自A企業,A1產品芳樟醇含量最低,為(12.30±0.72)μg/100mL,A2(國藥準字)產品芳樟醇含量最高,達到(31.47±4.52)μg/100 mL,且與其他產品含量均有顯著差異(P＜0.05)；其次是C企業的C7和C10兩種產品芳樟醇含量較高,分別為(22.75±1.66)μg/100 mL和(22.12±2.26)μg/100 mL,且與其他產品含量差異顯著(P＜0.05)；C企業8種產品和B企業4種產品的芳樟醇含量基本平穩,在14.90～18.62μg/100 mL之間。從生產企業自身看,A企業的兩種金銀花露產品芳樟醇含量差異極其明顯,反映了兩種產品作為藥品和食品飲料的不同定位,但在質量控制上,兩個批號的A1產品芳樟醇含量穩定,三個批號A2產品中一個批號的芳樟醇含量差異顯著(P＜0.05)；B企業的B4產品也出現一個批號的芳樟醇含量差異顯著(P＜0.05)；C企業的10種產品中,C6、C7、C8三種產品的不同批號均存在芳樟醇含量的顯著差異(P＜0.05),其他7種產品不同批次間的芳樟醇含量則無差異(P＞0.05),質量穩定。根據表5和圖3,所檢測的52個批號樣品中,芳樟醇含量在12.30～31.47μg/100 mL范圍變動,部分企業的產品甚至未檢測到芳樟醇信號,且同一產品的不同批次間芳樟醇含量指標也存在顯著性差異(P＜0.05)。

表5 金銀花露樣品中芳樟醇含量測定結果(n=3)Table 5 Determination results of linalool contents of L.japonica distillate samples

圖3 16種金銀花露樣品的芳樟醇含量對比Fig.3 Comparison of linalool contents among 16 kinds of L.japonica distillate samples

2.4 討論

為深入比較金銀花原料與金銀花露產品中芳樟醇含量,從本地企業實地取樣,測的羅田金銀花干花中芳樟醇含量為(22.12±1.45)μg/g,該結果雖較萬琴等［19］測定的河南、山東、江蘇等產地金銀花藥材中芳樟醇含量低,但與何俊婷等［9］測定的山東平邑金銀花芳樟醇含量相當。按大別山的羅田金銀花1 g干花加工成100 mL金銀花露折算(金銀花原料成本低至0.1元/100 mL),該類產品芳樟醇含量應該≥22.12μg/100 mL,達到該指標值的只有A2、C7和C10三種金銀花露產品。

3 結論

以正辛醇為內標物,建立了金銀花露中芳樟醇含量指標測定的氣相色譜法。該方法簡便、準確、可靠,芳樟醇最小檢出限為0.10μg/mL。利用該方法檢測了大別山地區24種金銀花露產品的52個批號樣品,8種產品未檢出芳樟醇信號,16種產品的芳樟醇含量在12.30～31.47μg/100 mL范圍變化,僅3種產品100 mL劑量達到羅田金銀花1 g干花的芳樟醇含量,且部分批次產品間芳樟醇含量差異顯著(P＜0.05),質量不穩定。測定結果說明金銀花露產品質量有待進一步規范和完善,并能以芳樟醇含量作為其質量控制的指標,從而為金銀花露的質量控制提供了試驗依據。

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