骨刺片高效薄層色譜法鑒別方法研究*

查 凡 ，聶黎行 ，于健東 ，戴 忠 ，馬雙成

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050； 2.中國藥科大學，江蘇 南京 211198）

骨刺片由杜仲葉、雞血藤、威靈仙、骨碎補、桂枝、延胡索、牡蠣（煅）、馬錢子粉、三七、制草烏、白芍等15味藥材組方，具有散風邪、祛寒濕、舒筋活血、通絡止痛的功效[1]。其適用于頸椎、胸椎、腰椎、跟骨等骨關節增生性疾病，對風濕、類風濕關節炎有一定療效[2－6]。除馬錢子粉、三七、白芍外，其余藥味均經水或酸性乙醇提取后入藥。其現行標準收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第十七冊)》，收載了馬錢子粉、三七、白芍的顯微鑒別和馬錢子粉的含量測定項目，對其余藥味缺乏質量控制。本研究中采用高效硅膠薄層色譜結合一板多測技術[7－9]對其余藥味的鑒別方法進行研究，建立了桂枝、威靈仙、延胡索和骨碎補的鑒別方法，為提高骨刺片的質量標準提供了依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Mettler AE240型十萬分之一電子天平、Mettler FX－200型千分之一電子天平；CAMAG Linomat－5型半自動點樣臺；CAMAG Reportstar型薄層色譜攝像系統；KQ－300DA型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；高效硅膠G薄層板（Merck公司）；聚酰胺薄層板（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 試藥

乙醇、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90℃）、甲酸、硫酸、氫氧化鈉、甲苯、丙酮、碘、三氯甲烷、丁酮、甲醇均為分析純，購于北京市化學試劑公司，水為超純水。骨刺片18批，均為2017年國家藥品監督抽驗樣品，詳見表 1；桂枝（批號 121191－201103）、杜仲葉（批號121068－201302）、川烏（批號 121408－201402）、白芍（批號 120905－201109）、骨碎補（批號 121169－201304）、威靈仙（批號 121189－201102）、草烏（批號121338－200401）、三七（批號 120941－201108）、黨參（批號 121057－201206）、延胡索（批號 120928－201208）、馬錢子（批號 121164－200302）對照藥材，齊墩果酸對照品（批號 110709－201607，含量以 91.7%計），延胡索乙素對照品（批號110726－201718，含量以99.6%計），柚皮苷對照品（批號 110722－201613，含量以94.3%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；昆布（海帶科植物海帶 Laminaria japonica Aresch的干燥葉狀體）、雞血藤（豆科植物密花豆 Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖）、牡蠣（牡蠣科動物長牡蠣 Ostrea gigas Thunberg的貝殼）、附子（毛茛科植物烏頭 Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品）購于北京同仁堂藥店，經中國食品藥品檢定研究院聶黎行副研究員鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 桂枝和威靈仙

取本品10片，粉碎，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液（臨用現配）。另取桂枝對照藥材0.5 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液（臨用現配）。取齊墩果酸對照品適量，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。取相應藥材，按處方和制法分別制得缺桂枝和缺威靈仙的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典(四部)》通則0502）試驗，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液、桂枝對照藥材溶液各 20 μL，齊墩果酸對照品溶液2 μL，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯－甲酸（15 ∶5 ∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視(鑒別桂枝)，供試品溶液色譜中，在與桂枝對照藥材溶液色譜相應位置上，應顯相同顏色的紅色熒光斑點。噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰，在紫外光燈（365 nm）下檢視(鑒別威靈仙)，供試品溶液色譜中，在與齊墩果酸對照品溶液色譜相應位置上應顯相同顏色的熒光斑點（見圖1）。結果3個廠家的6批樣品檢出桂枝，合格率為33.33%；7個廠家的11批樣品檢出威靈仙，合格率為61.11%。詳見表1。

2.2 延胡索

取本品10片，粉碎，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，得濾液，作為供試品溶液。另取延胡索對照藥材0.5 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取延胡索乙素對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取相應藥材，按處方和制法制得缺延胡索的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典(四部)》通則0502）試驗，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液、延胡索對照藥材溶液各20 μL，延胡索乙素對照品溶液2 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的高效硅膠G薄層板上，以甲苯－丙酮（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，碘熏至斑點顯色清晰，在紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應位置上，應顯相同顏色的熒光斑點（見圖2）。結果7個廠家的14批樣品檢出延胡索，合格率為77.78%，詳見表1。

圖1 骨刺片中桂枝、威靈仙的薄層色譜鑒別圖

圖2 骨刺片中延胡索的薄層色譜鑒別圖

2.3 骨碎補

取本品50片，粉碎，加三氯甲烷80 mL，超聲處理30 min，放至室溫，濾過，藥渣用三氯甲烷洗滌2次，每次10 mL，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干，加乙酸乙酯80 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取柚皮苷對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取相應藥材，按處方和制法制得缺骨碎補的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。照薄層色譜法（2015 年版《中國藥典(四部)》通則 0502）試驗，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，柚皮苷對照品溶液2 μL，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－丁酮－甲醇－水（10 ∶6 ∶2 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上，應顯相同顏色的熒光斑點（見圖3）。結果9個廠家的15批樣品檢出骨碎補，合格率為83.33%，詳見表1。

圖3 骨刺片中骨碎補的薄層色譜鑒別圖

表1 18批骨刺片樣品薄層色譜鑒別結果

3 討論

本研究中采用高效薄層技術，建立了骨刺片中桂枝、威靈仙、延胡索和骨碎補的鑒別方法，有效填補了現行標準質量控制項目的缺失，可更加全面地反映制劑質量。結果顯示，10個廠家生產的18批骨刺片樣品中，只有3個廠家的6批樣品能全部檢出桂枝、威靈仙、延胡索和骨碎補4味藥材，有2批樣品能檢出3味藥材，有7批樣品能檢出2味藥材，有2批樣品只能檢出1味藥材，有1批樣品4味藥材均未檢出。4味藥材中，延胡索和骨碎補的檢出率較高，桂枝的檢出率最低。以上現象表明，部分企業在投料方面存在問題，不排除其對現行標準尚未規定檢測項目的藥材未嚴格按照處方量投料的可能。

骨刺片中桂枝經水煎煮后入藥，試驗中曾采用桂皮醛和肉桂酸為對照進行鑒別，均未檢出相應斑點，推測上述成分經長時間加熱后分解。轉而以桂枝對照藥材為對照，發現其與骨刺片樣品經乙酸乙酯提取后，在紫外光燈（365 nm）下均可觀察到明顯的特征性紅色熒光斑點，且陰性無干擾。同一供試品溶液，顯色后還可用于方中威靈仙的鑒別，實現了一板多測，提高了檢驗效率。經多次試驗后發現，溶液放置時間增加，上述熒光斑點亮度明顯減弱，故鑒別桂枝時，供試品溶液和桂枝對照藥材溶液均需臨用現配。

骨碎補含柚皮苷等黃酮類成分，試驗中曾采用聚酰胺薄層對骨刺片中的骨碎補加以鑒別，結果顯示，供試品溶液色譜背景干擾嚴重，影響柚皮苷的檢視，故轉而采用高效硅膠薄層進行研究。

骨刺片由15味中藥組方，基質復雜，大部分藥味經水或酸性乙醇提取后入藥，造成特征成分相對含量較低，這些都給鑒別方法的開發帶來了挑戰。對比試驗結果表明，采用高效硅膠薄層鑒別桂枝、威靈仙、延胡索和骨碎補，相比普通硅膠薄層，靈敏度高、分離度好、誤判率低。試驗中還采用多種指標和方法研究方中其他藥味的鑒別方法，但因陰性干擾（如杜仲葉）或指標成分含量過低（如黨參）等原因未能成功。

化學分析技術的發展為中藥的質量評價提供了各種新興手段[10－16]，經典的薄層鑒別方法越來越不受重視。本研究結果表明，薄層色譜技術能簡便、經濟、快速地揭示藥品質量隱患，在中成藥的真偽鑒別方面仍舊發揮著獨特而不可或缺的作用。

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