小兒葛黃止瀉顆粒質量標準研究

姚 能 ，嚴常開 ，吳 寧 ，郭 皓 ，何建華

（1.湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065； 2.武漢藥谷科技開發有限公司，湖北 武漢 430200）

小兒葛黃止瀉顆粒由葛根、黃連、木香等組方，由中醫經典名方葛根芩連湯結合臨床經驗添加白術、木香演變而成，為中藥六類新藥品種，有解肌清熱、止瀉止痢功效，適用于小兒因濕熱蘊結所致的泄瀉、痢疾、泄瀉腹痛、便黃而黏、肛門灼熱[1]333。方中葛根味甘、辛，性涼，性清輕升發，入脾胃經，既能解表退熱，又能升發脾胃清陽之氣而治下利，是一物而二任也，故為君藥[2]；黃芩和黃連清熱瀉火、清熱燥濕利尿，為臣藥[3]；木香行氣止痛、健脾消食，炒白術健脾益氣、燥濕利水，二者共為佐藥；甘草甘緩和中，調和諸藥，為使藥[4]。合而為方，可升陽止瀉、清熱燥濕、瀉火解毒、行氣止痛、健脾消食。為了有效控制產品質量，本研究中建立了鑒別葛根、黃連、黃芩、木香的薄層色譜（TLC）法及測定葛根素含量的高效液相色譜（HPLC）法，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀，含LC－15型色譜泵，SPD－15C型紫外檢測器，LC－20AT型色譜泵，SIL－20A型紫外檢測器，島津LC Solution Lite工作站（日本島津公司）；UV－170型紫外分光光度計（日本島津公司）；613T超聲波清洗機（深圳市潔拓電子科技有限公司，360 W，40 kHz）；204AL型電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

小兒葛黃止瀉顆粒（10批，武漢藥谷科技開發有限公司，規格為4 g/袋）；葛根素對照品（批號為110752－201514，含量為 95.5%），去氫木香內酯對照品（批號111525－201510，含量為 99.8% ），黃芩素對照品（批號為 111595－200905，含量為 98.5%），黃連對照藥材（批號為121551－201404），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甲醇等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

葛根與黃連[5－6]：取小兒葛黃止瀉顆粒約 0.4 g，置50 mL錐形瓶中，加甲醇 25 mL，密塞，超聲 30 min，濾過，取續濾液，即得供試品溶液；分別取缺葛根、黃連的陰性樣品各約0.4 g，同法制成陰性對照品溶液；取黃連對照藥材0.4 g，同法制成對照藥材溶液；另取葛根素對照品適量，加入甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述5種溶液各1 μL，點于同一1%NaOH硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水（13∶3∶5∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈下（345 nm）檢視。結果供試品溶液色譜展開效果較好，斑點清晰，陰性樣品無干擾，結果見圖1。

圖1 葛根與黃連TLC圖

木香[1]105：取小兒葛黃止瀉顆粒約 0.4 g，加甲醇10 mL，密塞，超聲10 min，濾過，溶液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，得供試品溶液；取缺木香的陰性樣品約0.4 g，同法制成陰性對照品溶液；另取去氫木香內酯對照品適量，加入甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，對照品溶液2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%香草醛硫酸，加熱至斑點清晰。結果供試品溶液色譜展開效果較好，斑點清晰，陰性樣品無干擾，結果見圖2。

圖2 木香TLC圖

黃芩[1]301：取小兒葛黃止瀉顆粒約0.4 g，加甲醇10 mL，密塞，超聲10 min，濾過，溶液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，取上清液，作為供試品溶液；取缺黃芩的陰性樣品約0.4 g，同法制成陰性對照品溶液；取黃芩素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，黃芩素對照品溶液2 μL，點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（10∶3∶1∶2）為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%FeCl3溶液，加熱至斑點清晰。結果供試品溶液色譜展開效果較好，斑點清晰，陰性樣品無干擾，結果見圖3。

圖3 黃芩TLC圖

2.2 葛根素含量測定[7]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Sepax BR－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－水（21 ∶79）；流速：1.0 mL /min；檢測波長：250 nm；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。理論板數按葛根素峰計算應不低于5 000。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取葛根素對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成每1 mL中含葛根素20 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取小兒葛黃止瀉顆粒約0.52 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，密塞，超聲提取20 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL置10 mL容量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：取除葛根外的其余藥材，按小兒葛黃止瀉顆粒處方制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密量取2.2.2項下3種溶液各5 μL，在250 nm波長下進樣，記錄色譜圖。結果陰性對照品溶液在與對照品溶液及供試品溶液色譜相應保留時間處無相應色譜峰，表明陰性對照無干擾，專屬性強。結果見圖4。

圖4 葛根素HPLC色譜圖

線性關系考察：分別精密量取葛根素質量濃度為389.64 μg /mL 的對照品溶液（母液），加甲醇稀釋(1 mL→100 mL，1 mL→50 mL，1 mL→25 mL，3 mL→50 mL，2 mL→25 mL，3 mL→25 mL)，分別精密吸取上述稀釋后溶液各5 μL，分別進樣后測定。以對照品溶液質量濃度（μg/mL，X）為橫坐標、峰面積積分值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝4 772 911.51 X－858.55，r＝0.999 9（n ＝6）。結果表明，葛根素質量濃度在 3.90 ～46.76 μg/mL 范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗：精密量取質量濃度為 15.59 μg/mL的對照品溶液，按擬訂條件連續進樣6次，計算峰面積。結果的 RSD為0.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批(批號為20170601)供試品溶液，分別于 0，3，6，9，12，15，18，21，24 h 時進樣，記錄峰面積。結果的 RSD為0.48%（n＝9），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為20170601）樣品干膏粉6份，依法制備供試品溶液。結果葛根素峰面積的RSD為0.56%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知葛根素含量（重復性試驗項下）的樣品（批號為 20170601）6份，每份約 0.26 g，精密稱定，分別精密加入質量濃度為 346 μg/mL的對照品溶液各10 mL，依法制備供試品溶液，按2.2.1項下擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

按上述供試品溶液制備方法和測定條件，測定10批樣品中葛根素含量。結果見表2。

表2 10批樣品含量測定結果（mg/g，n＝10）

3 討論

3.1 定性鑒別

本研究中采用TLC法鑒別葛根、黃連，通過對樣品的提取方法、點樣量、展開劑種類、溶劑比例等條件進行了篩選，發現在鑒別葛根時，在供試品溶液色譜中發現有與黃連對照藥材相同顏色的斑點，通過試驗證實，該斑點與黃連對照藥材斑點一致，故將黃連與葛根采用相同方法進行鑒別，能有效、快速地鑒別出葛根與黃連。該方法分離度良好，專屬性強，可作為葛根、黃連定性鑒別的參考方法。

3.2 定量測定

本研究中采用HPLC法測定小兒葛黃止瀉顆粒中葛根素的含量，參考了2015年版《中國藥典（一部）》中葛根藥材及葛黃芩連丸中含量測定項下的葛根素含量測定方法，結果保留時間較短，樣品中主峰與雜質峰無法分開，分離度、理論板數均不理想，最后通過改變流動相比例，確定了甲醇－水（21∶79）為葛根素含量測定的流動相，結果獲到了較好的峰型和分離度。

3.3 提取條件考察

本研究中在測定葛根素含量時，進行了提取方式、提取溶劑、提取時間等諸多項的考察，最終確定了以甲醇為溶劑，超聲處理20 min為處理方法的制備方法，該方法測得結果含量高，穩定性好，重復性高，對小兒葛黃止瀉顆粒質量標準的建立提供了依據。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2]黃泰康，施 誠.中藥方劑現代研究大典[M].北京：科學技術出版社，1996：1217.

[3]劉 容，司曉莉.葛根芩連湯對脾胃濕熱證大鼠的治療作用研究[J].南京中醫藥大學學報，2014，30（3）：287－290.

[4]漢·張仲景.傷寒論[M].北京：中醫古籍出版社，1997：22.

[5]宋鳳蘭，何 洋，何 琳，等.葛根芩連滴丸的質量標準研究[J].廣東藥學院學報，2014，30（4）：439－443.

[6]李 希，羅先本，謝守德，等.黃連配方顆粒質量標準研究[J].中成藥，2004，26（12）：32－34.

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