高效液相色譜法測定利卡西平血藥濃度

周清武

（四川省綿陽市中心醫院藥學部，四川 綿陽 621000）

利卡西平（licarbazepine，monohydroxycarbamzepine，MHD）[1－2]為較新型的廣譜抗癲癇藥物[3]，可單獨應用或與其他抗癲癇藥合用治療局限性及全身性癲癇發作，對頑固性癲癇也有作用[4－5]。其前體藥物奧卡西平（OXC），在體內吸收快而完全，并能迅速轉化為利卡西平[6]。利卡西平為一級動力學腎消除，兒童消除較快[7]，穩態藥物濃度較低，影響了其臨床有效應用，而老人消除較慢。其嗜睡及低鈉血癥等嚴重不良反應的出現，影響了該藥物在臨床的安全應用[8]。為安全有效地用好利卡西平，進行藥物濃度監測很有必要，近年來相關研究較多。為尋找適合于本實驗室的準確、靈敏、簡單和快捷的檢測方法，本研究中優化色譜條件及血樣處理流程，建立了測定人血漿利卡西平藥物濃度的高效液相色譜（HPLC）法，有利于更好地指導臨床奧卡西平的個體化合理用藥。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Beckman Coulter高效液相色譜儀（美國 Beckman公司，包括 RC－11微量進樣器，HT－230A柱溫箱，System Gold 126溶劑泵，System Gold 166紫外檢測器）；KJO－4282 C18保護柱（4 mm×3 mm，Phenomenex公司）；FA1004 型電子天平（感量為 0.1 mg，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；TG16－Ⅱ型臺式高速離心機（長沙平風儀器儀表有限公司）；Qilinbeier旋渦混勻器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Qiujing移液器（上海求精生化儀器廠）；T10205－94微型打氣筒（邢臺平鄉振興打氣筒廠）。

1.2 試藥

利卡西平標準品（美國，批號D0305A）；多索茶堿葡萄糖注射液（安徽國森藥業有限公司，批號為161028022，規格為每瓶 100 mL∶多索茶堿 0.3 g與葡萄糖5 g）；乙腈（成都市科龍化工試劑廠，色譜純）；異丙醇（成都市科龍化工試劑廠，分析純）；乙二醇和無水乙醇（成都金山化學試劑有限公司，分析純）；冰醋酸（臺山市新寧制藥有限公司）；滅菌注射用水（四川科倫藥業股份有限公司）；血漿樣品，取自本院做治療藥物濃度監測的門診及住院患者。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：BeckmanCoultrer－ODS柱（250mm×4.6mm，5 μm），KJO－4282 C18型保護柱（4 mm ×3 mm）；流動相：乙腈－0.3% 醋酸（24 ∶76，V/V）；流速：1.1 mL /min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：240 nm，記錄時間為10 min；進樣量：20 μL；檢測靈敏度：0.1 mAU。

2.2 溶劑制備

標準貯備液：稱取50.0 mg利卡西平，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容，即得質量濃度 1 000 μg/mL的利卡西平標準濃配液，取 20.0 mL濃配液，用乙二醇－水（37∶13）稀釋至 100mL，即得 200μg/mL的利卡西平標準貯備液，密封，貯于－20℃冰箱中備用。用前吸取少量置1.5 mL塑料離心管中并密封，在26℃水浴中靜置10 min平衡至室溫。

內標液：精密量取多索茶堿葡萄糖注射液（100 mL∶多索茶堿 0.3 g）8.0 mL，加乙二醇－水（37 ∶13）稀釋至100 mL，即得質量濃度為240 μg/mL的多索茶堿內標液，密封，貯于－20℃冰箱中備用。用前吸取少量置1.5mL塑料離心管中并密封，在26℃水浴中靜置10 min平衡至室溫。

2.3 血漿樣品處理

在10 mL PVC塑料試管中加入樣品血漿400 μL，240 μg/mL 多索茶堿內標液 40 μL，空白全血 40 μL 作為色標，渦漩 10 s，混勻，加異丙醇 100 μL，乙酸乙酯2.0 mL，再旋渦 30 s，萃取，以 2 000 r/min 的速率離心10 s分離血漿蛋白，取盡上層無色酯液20 mL錐形試管中，錐形試管置40℃水浴瓶中，用微型打氣筒鼓入空氣使揮干，加注射用水 100 μL，渦漩 10 s，使萃取物溶解或混勻，取20 μL上機檢測。

2.4 方法學考察

專屬性考察：分別用注射用水和空白血漿稀釋利卡西平標準貯備液，得質量濃度為25 μg/mL的利卡西平標準水溶液和利卡西平標準血漿液。利卡西平標準水溶液參照2.3項下方法，加入多索茶堿內標后混勻檢測；空白血漿和利卡西平標準血漿液分別按2.3項下方法處理后檢測。結果表明，血漿雜質對內標和利卡西平的檢測均無干擾，雜質、內標與利卡西平分離完全，保留時間分別為 2.5，3.9，7.2 min，重復性良好。色譜圖見圖 1。

標準曲線繪制與檢測限測定：取6支10 mL PVC塑料試管，分別加入質量濃度為200 μg/mL的利卡西平標準貯備液適量，用空白血漿稀釋，渦漩10 s使混勻，得質量濃度為 2，10，20，30，40，50 μg/mL 的系列血漿利卡西平標準工作液各400 μL。其余操作同2.3項下方法，得HPLC系列色譜圖，以血漿利卡西平質量濃度（C）對標準品與內標物的峰高比（Y）進行線性回歸，得標準曲線方程 C ＝31.480 2 Y－0.060 8，r＝0.999 8（n ＝ 5）。最低檢測限為 0.5 μg/mL。

精密度與準確度試驗：精密度以日內和日間 RSD表示。準確度以測得濃度與配制濃度的接近程度（相對誤差）來表示，測得濃度/配制濃度×100%，即為方法回收率。用空白血漿分別稀釋質量濃度為200 μg/mL的利卡西平標準貯備液，得高、中、低質量濃度（30，10，2 μg/mL）的血漿利卡西平標準樣品，按 2.3 項下方法處理，各樣品日內重復操作5次，考察日內精密度及準確度；連續測定5 d，考察日間精密度。結果顯示，日內精密度的 RSD ＜5.84%(n＝5)，方法回收率為 99.40% ～103.50%，平均相對誤差為－0.60% ～3.50%，日間精密度的 RSD＜6.42%(n＝5)。符合 2010年版《中國藥典（二部）》中生物樣品檢測的 RSD應小于15%，相對誤差在±15%以內的基本要求[9]。結果見表1。

提取回收率試驗：分別用注射用水和空白血漿稀釋質量濃度為200 μg/mL的利卡西平標準貯備液，得高、中、低質量濃度（30，10，2 μg /mL）的利卡西平水溶液標準樣品和利卡西平加標血漿樣品各400 μL。水溶液標準樣品分別加入質量濃度為240 μg/mL的多索茶堿內標40 μL，渦漩10 s混勻后上機檢測。加標血漿樣品按2.3項下方法處理后檢測。同法操作5次。用利卡西平的血漿檢測濃度/水溶液檢測濃度×100%，計算提取回收率。結果顯示，高、中、低質量濃度加標血漿樣品的平均提取回收率分別為 77.20% ，77.02% ，79.94% ，RSD 分別為 2.33%，1.92%，5.83% （n ＝ 5）。

圖1 高效液相色譜圖

表1 利卡西平的精密度與準確度試驗結果（±s，n＝5）

表1 利卡西平的精密度與準確度試驗結果（±s，n＝5）

配制質量濃度（μg /mL）30 10 2日內精密度日間精密度測定質量濃度（μg/mL）30.29 ± 0.72 9.94 ± 0.19 2.07 ± 0.12方法回收率（%）100.97 99.40 103.50平均相對誤差（%）0.97－0.60 3.50 RSD（% ）2.33 1.91 5.83測定質量濃度（μg/mL）29.82 ± 0.40 9.84 ± 0.29 2.02 ± 0.09 RSD（% ）1.98 4.37 6.41

穩定性試驗：分別配制利卡西平高、中、低質量濃度（30，10，2 μg /mL）的加標血漿樣品，各質量濃度分別配制 5 份，室溫避光放置，并分別于 0，2，4，6，8 h 時，檢測利卡西平的質量濃度。結果顯示，各樣品室溫放置8 h內的質量濃度變化較小，RSD介于 0.93%～5.38%（n＝5）。

干擾性試驗：在收集到的68例臨床利卡西平血樣中，有些患者合用了左乙拉西坦、苯妥英鈉、拉莫三嗪、丙戊酸鈉、卡馬西平、托吡酯、地西泮和氯硝西泮等抗癲癇藥物中的個別藥物，或其他非抗癲癇藥物，在檢測利卡西平血藥濃度時，均未發現有干擾現象。

2.5 臨床應用

某患者，女，32歲，身高155 cm，體質量 55 kg，使用奧卡西平近2個月，目前口服奧卡西平300 mg，每天2次，近次給藥的10.5 h采血送檢，檢測質量濃度為8.53 μg /mL，應用藥代動力學公式原理計算，得知患者利卡西平的消除半衰期（t1/2）為 10.4 h，現在可能的穩態谷峰質量濃度波動范圍為 8.0 ～ 10.0 μg/mL，低于有效質量濃度參考范圍（12 ～ 35 μg /mL）[10－11]，近期偶有癲癇發作，腎消除速率居中[群體 t1/2為（9.3 ± 1.8）h]，為有效性考慮，藥師建議：口服奧卡西平600 mg，每天2次，患者將來可能的利卡西平穩態谷峰質量濃度波動范圍為 16.0 ～20.0 μg/mL，1 周后可復查藥物穩態谷質量濃度。

3 討論

流動相選擇：有文獻使用磷酸鹽作流動相[1]，優點是可提供較穩定的酸性環境，色譜穩定性較好，缺點是磷酸鹽濃度較高，易堵塞色譜柱，損傷溶劑泵，且配制較煩瑣，易長霉；也有文獻用三氟乙酸[12]或甲酸[13]提供酸性環境，因本實驗室貯備有冰醋酸，故用0.3%的醋酸提供酸性環境，色譜效果較好，具有醋酸濃度較低、容易配制、合用乙腈、流動相組成較簡單等優點。

血樣處理方法考察：有文獻使用甲醇沉淀血漿蛋白[14]，也有文獻用乙醚[1]、二氯甲烷[12]、甲基叔丁基醚[15]和乙酸乙酯[13，16]處理血樣，有文獻加用異丙醇提高回收率[12]。考慮到甲醇、二氯甲烷對人體毒性較大，乙醚回收率較低，甲基叔丁基醚較難得到，故選用毒性較小的乙酸乙酯＋異丙醇處理血漿樣品，利卡西平萃取率較理想，雜質、內標和樣品峰形較尖銳，分離較好。

波長選擇：利卡西平檢測波長多選擇210～240 nm的較短波長[12，15]，但波長越短，雜質峰越多，基線容易飄移，故本研究中選用240 nm作為檢測波長。

內標選擇：多索茶堿葡萄糖注射液的室溫有效期可達2年（說明書），有文獻報道可用作HPLC檢測內標[17]，且患者體內多不含多索茶堿。研究顯示，多索茶堿與利卡西平樣品及血漿雜質之間分離度和重復性都比較好。用乙二醇－水（37∶13）混合溶劑配制利卡西平的標準貯備液和多索茶堿內標液，優點是在－20℃的冰箱中貯存不會結冰，用時便于吸取，在26℃水浴中靜置10 min平衡至室溫后，溶劑揮發很少，吸水也很少，配制試劑的質量濃度穩定性較好。

鼠標讀數：試驗發現，在確定沒有雜質峰與樣品或內標峰有重疊的情況下，內標和樣品的峰前較遠處，有時會因倒峰現象而導致電腦的峰高讀數產生較大偏差，如果改用鼠標讀數，即用鼠標在檢測峰最高點與峰前近低點的讀數差，得到絕對峰高值，讀數會比電腦直接讀數準確。

溶劑選擇：利卡西平的樣品提取物常用流動相或甲醇溶解，但考慮到毒性問題，本實驗室用注射用水100 μL作替代溶劑，混合得到澄明或乳濁液體，上機試驗，無保護柱堵塞情況，效果良好。

有效質量濃度：利卡西平的有效質量濃度參考范圍目前尚無定論，一般認為是 3 ～35 μg /mL[18]。但有文獻報道為 12 ～35 μg /mL[10－11]時，可更好地控制癲癇發作；大于 35 μg/mL 時，易發生疲勞、頭痛、頭暈、嗜睡、低鈉血癥等不良反應（說明書）。

相關參數：利卡西平的群體藥代動力學參數，奧卡西平片有說明書記載，吸收分數（F）大于0.95，表觀分布容積（Vd）為 0.68 L /kg，達峰時間（Tm）為 5 h，腎消除分數（Fu）大于 0.95，兒童 t1/2為 5 ～9 h，成人 t1/2為（9.3 ±1.8） h，老人更長。群體藥代動力學參數結合血藥濃度檢測值等個體藥代動力學參數，應用藥代動力學公式原理，能較準確地推算出患者個體的利卡西平消除半衰期和穩態血藥濃度波動范圍，便于指導患者個體化合理用藥。

參考文獻：

[1]何益鋒，程 鋼，周述香，等.高效液相色譜法測定人血漿中奧卡西平活性代謝物利卡西平的濃度[J].中南藥學，2011，9（9）：683－686.

[2]馮健全，許俊羽，吳 曄，等.RP－HPLC法測定人血漿和唾液中奧卡西平活性代謝物的濃度[J].中國藥理學雜志，2013，29（4）：299－301.

[3]勞榮巨，李偉恩，胡榮亮，等.奧卡西平治療兒童癲癇血藥濃度監測及其臨床應用研究[J].中國藥業，2016，25（17）：88－90.

[4]李 霞，劉小紅，楊 樂.不同年齡階段癲癇患兒奧卡西平活性代謝物血藥濃度的臨床價值[J].現代檢驗醫學雜志，2015，30（1）：143－148.

[5]張瑞曉.奧卡西平治療兒童癲癇64例[J].山東醫藥，2014，54（8）：104－105.

[6]田 潔，宋少剛，時 濤，等.RP－HPLC法測定血漿中奧卡西平及其代謝產物的濃度 [J].中國藥師，2009，12（12）：1689－1691.

[7]馬 婧，黃曉會，陳霽暉，等.癲癇患兒奧卡西平活性代謝產物血藥濃度監測結果分析 [J].中國醫藥，2016，11（11）：1634－1636.

[8]汪 洋，張華年，陳渝軍，等.奧卡西平活性代謝物血清濃度與臨床療效和安全性的關系[J].醫藥導報，2016，35（9）：955－959.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄196.

[10]單若瑩.奧卡西平治療成人癲癇發作的血藥濃度、臨床療效和安全性探討 [J].中國繼續醫學教育，2015，7（15）：132－133.

[11]鄒 蓉，趙合慶，戴永萍，等.年齡及聯合用藥對癲癇患者奧卡西平血藥濃度的影響[J].臨床神經病學雜志，2015，28（2）：110－113.

[12]楊常成，段小月.用RP－HPLC法同時測定拉莫三嗪和奧卡西平的血藥濃度[J].藥學服務與研究，2009，9（4）：295－297.

[13]張全英，徐文俊，俞蘊莉.高效液相色譜法測定癲癇患者血漿中奧卡西平活性代謝物的濃度及其血藥濃度與療效關系評價[J].中國生化藥物雜志，2015，35（1）：106－109.

[14]林志燕，劉海濤，舒 揚，等.217例次癲癇患兒血清奧卡西平代謝物濃度監測分析[J].醫藥導報，2013，32（1）：12－14.

[15]遲丹怡，李中東，焦 正，等.人血漿中奧卡西平及其代謝物10－羥基卡馬西平的HPLC法測定[J].藥物分析雜志，2006，26（9）：1195－1198.

[16]謝 寧，林志霞，楊紅梅，等.HPLC法測定人血漿中奧卡西平及其活性代謝產物的濃度[J].中國藥房，2015，26（11）：1496－1498.

[17]朱金平，林秀麗，陳春枚，等.互為內標法測定人血清茶堿與多索茶堿的濃度[J].海峽藥學，2011，23（6）：243－245.

[18]中華醫學會兒科學分會臨床藥理學組.兒童治療性藥物監測專家共識[J].中華兒科雜志，2015，53（9）：650－659.