紫外線和熱力對55型腺病毒的滅活效果

劉 媛，王文博，鄒自英，邱 薇，范泉水，馮子良，熊 杰

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）是一類無包膜的雙鏈DNA病毒，分為A～G 7個血清學組，60多個血清型。其中B組腺病毒感染目前已成為急性呼吸系統疾病的重要病原，其中引起軍隊新兵呼吸道感染流行的主要是腺病毒3型、7型和55型[1-5]。其中55型腺病毒（HAdV-55）是基于HAdV-B14型基因組骨架嵌合HAdV-B11型Hexon部分片段的重組新病毒，屬于B組的B2亞組。該病毒第一次在我國引起感染疫情發生在2006年3～4月陜西岐山縣[3]。近年來，HAdV-B55在成人特別是在學校和軍隊特殊人群中，引起日益頻繁的急性呼吸道傳染病流行[4-5]。另外也有研究表明，HAdV-55感染是成人社區獲得性肺炎的重要病因之一，成人腺病毒肺炎流行有明顯季節性，多在每年的2～3月份流感流行后期發生[6]。

由于腺病毒屬于DNA病毒，且沒有包膜，病毒本身比較穩定，能夠在環境中存活時間相對較長。為了解紫外線和熱力對HAdV-55的滅活效果，本研究開展了相關實驗，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 人喉癌上皮細胞HEp-2購自中國科學院上海細胞庫，由本實驗室保存培養；GIBCO胎牛血清、DMEM、青/鏈霉素、Invitrogen PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；引物和PCR試劑購自成都擎科梓熙生物技術有限公司；生化試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 HAdV-55毒株 病毒毒株SF04/SC/2016為本實驗室前期從HAdV-55感染者咽拭子標本中分離獲得，按照Reed-Muench公式計算病毒滴度為2.5×105，具體信息見參考文獻[7]。

1.3 紫外線對HAdV-55的滅活試驗 取100μl病毒液（滴度為2.5×105）平鋪于48孔板底部，均勻涂布孔底，形成一層薄層，隨機分為紫外照射30min組、1 h組和2 h組及對照組。紫外照射組置于超凈臺紫外燈下，紫外線波長254 nm，功率20瓦（W），距離60 cm，分別照射30min、1 h和2 h；對照組不進行紫外線照射。紫外線照射組照射完成后，采用實時定量PCR（RT-PCR）法檢測病毒液中HAdV-55 DNA水平。然后將4組分別接種HEp-2細胞，1×105個/孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。培養24 h后，檢測細胞內病毒DNA水平；培養72 h后，收集細胞上清，采用Reed-Muench法檢測上清液中病毒滴度。

1.4 熱力對HAdV-55的滅活試驗 將100μl病毒（滴度為2.5×105）加入1.5 ml離心管中，隨機分為熱力滅活30min組、1 h組和2 h組及對照組。熱力滅活組置于恒溫水浴鍋內，溫度設置為65℃，時間分別為30 min、1 h和2 h，對照組不進行熱力滅活，置于4℃暫存。熱力處理完成后，采用RT-PCR法檢測病毒液中HAdV-55 DNA水平。然后將4組病毒液各100μl分別置于48孔板中，接種HEp-2細胞，細胞密度 1×105個/孔，于 37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。此后，細胞內和細胞培養上清中病毒的檢測方法和步驟同1.3。

1.5 RT-PCR方法 采用Invitrogen PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit提取上述病毒分離液的腺病毒DNA，具體操作參照說明書進行。建立HAdV-55DNA檢測的標準曲線，對提取的腺病毒DNA水平進行定量檢測。相對定量以GAPDH作為內參基因，采用ΔΔCt法分析各組HAdV水平。所用引物如下，HAdV-F：5'-AGATGAAGAAAGTAAACCGATTT-3'；HAdV-R：5'-CCATCAAGGTCAGTCCAA-3'，預期產物86 bp；GAPDH-F：5'-TGGGCTACACTGAGCACCA G-3'，GAPDH-R：5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3'，預期產物 100 bp。

1.6 統計學方法 應用 SPSS 15.0軟件分析，計量數據以x±s表示，多組間差異采用單因素方差分析，兩組間比較采用Tukey檢驗，假設檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 紫外線對HAdV-55的滅活效果 紫外線照射30min、1 h和2 h后，紫外線照射組HAdV-55 DNA水平與對照組相比無顯著差異（P＞0.05，圖1A）。但紫外線照射組病毒感染HEp-2細胞水平降低，與對照組相比，紫外線照射30 min組細胞內病毒DNA水平降低約50%；紫外線照射1 h和2 h組細降低約 2個數量級（P＜0.05，圖1B）。

進一步檢測細胞培養上清中子代病毒滴度，結果顯示，對照組子代病毒滴度為（2.5±0.10）×105，紫外線照射30min組、1 h組和2 h組分別為（1.9±0.08）×103、（5.7±0.08）×10 和（2.3±0.05）×10。見圖 2。

圖2 各組子代病毒滴度比較

2.2 熱力對HAdV-55的滅活效果 65℃熱力滅活30min、1 h和2 h后，熱力滅活組HAdV-55 DNA水平與對照組相比顯著降低（P＜0.05，圖3A）。熱力滅活組病毒感染HEp-2細胞水平也降低，65℃處理30 min、1 h和2 h，病毒感染HEp-2水平降低＞104個數量級（P＜ 0.05，圖 3B）。

熱力滅活病毒感染細胞產生子代病毒的滴度也顯著降低。65℃處理30min病毒組感染細胞產生的子代病毒滴度為（2.04±0.06）×101；而 1 h 組和 2 h組產生的子代病毒，不能再次感染細胞。

3 討論

人腺病毒屬腺病毒科，是無包膜的DNA病毒，病毒的核心由雙鏈DNA及蛋白質組成，病毒的衣殼呈規則的20面體結構，直徑80～110 nm。人腺病毒無類脂質包膜，耐乙醚和氯仿等脂溶性消毒劑，耐酸，在環境中穩定性相對較高。由于病毒的有效滅活涉及到病毒的傳播和控制、生物安全等多個方面，因此，探討紫外線和熱力對腺病毒的滅活效果具有重要意義。

目前腺病毒的滅活主要使用含氯消毒劑。李杰等[8]研究了常用消毒劑對HAdV-55的滅活效果，發現用含有效氯400 mg/L的次氯酸鈉和600mg/L的過氧乙酸作用20min，或含有效碘1000mg/L的碘伏溶液作用40min，對HAdV-55的滅活對數值可≥4.00；而醋酸氯己定和苯扎氯銨等低效消毒劑對該病毒的滅活作用稍弱。

圖1 紫外照射對HAdV-55活力的影響

圖3 熱力滅活對HAdV-55病毒活力的影響

楊玲等[9]報道了紫外線照射對腺病毒氣溶膠活力和粒級分布的影響，采用HEK293包裝細胞制備綠色熒光蛋白標記的重組腺病毒，通過在熒光顯微鏡計數帶綠色熒光的PKl5細胞數以檢測病毒的感染力及活力，發現波長為254 nm的紫外線照射5 min時，細胞內感染的病毒數即明顯減少；254 nm紫外線照射30min時，感染細胞內不能檢測到綠色熒光。該研究還發現波長為254 nm的紫外線比365 nm的紫外線照射滅活腺病毒氣溶膠的效果更顯著。

本研究發現，波長254 nm的紫外線照射HAdV-55，對病毒DNA水平影響不大，但顯著降低病毒的感染活力。紫外線照射30 min后，細胞內病毒DNA水平降低約50%；照射1 h和2 h，細胞內病毒DNA水平降低約2個數量級，而且病毒感染細胞產生子代病毒的滴度也顯著降低，均證明紫外線照射可在一定程度上滅活腺病毒，采用紫外線照射能在一定程度上控制腺病毒的傳播。但由于實驗條件所限，本研究采用的紫外燈功率為20W，照射距離為60 cm，僅設置了照射時間一個變量。此外，由于紫外滅活的效果與時間、距離、功率、環境溫度、濕度等都有關，因此，在實際工作中，可通過適當延長紫外照射時間、縮短照射距離、提高照射功率等方法，提高滅活效果。

文獻報道，不同溫度對病毒滅活強弱效果也有差異[10-11]，65℃滅活病毒可作為篩選滅活疫苗株的一個條件。本研究結果顯示，熱力對HAdV-55的滅活作用較強，65℃處理30 min后，病毒感染水平的對數值降低4.0左右，產生子代病毒的滴度顯著降低；65℃處理1 h和2 h后，HAdV-55感染細胞產生的新病毒極少。因此，對腺病毒污染物品進行加熱消毒是可行且有效的。

254 nm紫外線和65℃熱力對HAdV-55均有不同程度的滅活作用，其中紫外線照射可作為實驗室空間整體消毒的一種方法，熱力滅活可作為篩選滅活疫苗株的一種手段，其中65℃熱力對HAdV-55處理1 h以上可使其不能產生子代病毒，為后續研究HAdV-55滅活疫苗提供參考。

【參考文獻】

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