甲氨蝶呤對類風濕性關節炎大鼠滑膜細胞凋亡基因調控的實驗研究*

周文旭，方 堃，譚湘淑，佘 君，梁 熹 ，劉 江，蒲 丹

1.西安交通大學第一附屬醫院(西安710061)，2.西安交通大學醫院(西安710049)

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種臨床常見的以侵犯關節滑膜、軟骨及骨為主的自身免疫病，病變過程多涉及多種細胞和細胞因子。位于關節滑膜內層的成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-likesynoviocytes, FLS)在RA病變中異?；罨墙閷шP節局部炎癥的關鍵細胞之一。有研究表明：類風濕關節炎的關節軟骨和骨組織損害，與滑膜細胞的過度增生活化與凋亡不足密切相關[1]。因此抑制炎性滑膜組織增生及誘導滑膜組織中各種細胞凋亡是類風濕性關節炎治療的靶點[2-3]。

甲氨蝶吟(Methotrexate, MTX)近多年來已成為RA臨床治療的基石用藥(Anchor drug)[4]。但對于其治療RA的作用機制尚不明確。本研究采用CIA模型，觀察甲氨蝶吟對大鼠整體療效及對滑膜組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、9蛋白的表達影響，進一步探討甲氨蝶吟治療RA的作用機制，為尋找新的抗類風濕關節炎藥物提供實驗依據。

材料與方法

1 實驗動物 SPF級健康雌性SD大鼠60只，體重(120±20)g，鼠齡4～5周，中國醫學科學院生物制品研究所提供。實驗開始前1周進行適應性飼養，保持室內22℃，自由攝食。

2 藥品與試劑 酸可溶性II型膠原蛋白(CII)與弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品。甲氨蝶吟片，2.5 mg購自上海醫藥有限公司信誼制藥總廠。Caspase-3，Caspase-9，Bax，Bcl-2和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG購自碧云天生物技術有限公司。Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；熒光定量試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司。引物由Invitrogen公司合成。藥物均研磨成粉末，采用生理鹽水制成所需濃度。

3 實驗方法

3.1 動物造模與分組:選取清潔級Wistar大鼠40只，體重50～100 g，用0.1 mmol/L醋酸溶解II型膠原蛋白(2 mg/ml，4℃，過夜)，再與等量的弗氏完全佐劑混合，于冰浴中充分乳化除正常組外，每只大鼠尾根部皮下多點注射膠原蛋白0.2 mg。造模后10 d將動物隨機分為假模型組，模型組，高、中、低給藥組各8只。各組給藥量如下：高劑量給藥組30 mg/kg，中劑量給藥組3 mg/kg，低劑量給藥組0.3 mg/kg，按10 ml/kg量灌胃，每日1次，假模型組，模型組給予等量生理鹽水灌胃，1.0 g/kg，1次/d。各組連續30 d用藥。分別于致炎后第14、16、18、20、24、28天用毛細管放大測量法測右后足體積，求出腫脹增長百分率=[(給藥后值-給藥前值)/給藥前值]×100%。

3.2 滑膜細胞分離培養:各組大鼠末次給藥后24 h，無菌操作取大鼠膝關節滑膜組織，并剪成1 mm3大小后加4 m1 0.4 mg/ml的II型膠原酶(溶于含10%胎牛血清的DMEM培養基)，于5% CO2條件下孵育3 h，離心收集未貼壁的細胞，將細胞重懸于含有15%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基，置37℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養。實驗用第2～4代細胞。實驗時用含15%小牛血清的DMEM培養液將滑膜細胞數調整至每毫升1×106個細胞加入6孔培養板內，每孔2 ml，于37℃、5%CO2培養箱培養4 h。

3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率：取對數生長期細胞，按細胞濃度為2×105/ml，每孔接種1 ml于6孔培養板。培養24 h后，吸棄殘余培養基，根據造模結果選取大鼠足腫脹抑制作用最有效的藥物濃度組(3 mg/kg MTX)，與未給藥的模型組共3個組。繼續培養24 h后吸棄上清液，PBS洗滌2次，胰酶消化收集細胞，重懸于離心管中，室溫下2000 r/min離心5 min。用Loading Buffer懸浮細胞，制備細胞懸液，向懸液中加入5 μl AnnexinV FITC和 10μl碘化丙啶(PI)，混勻。室溫避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。重復3次。

3.4 Caspase-3，Caspase-9，Bax，Bcl-2 蛋白表達測定:提取細胞總蛋白，后取蛋白質樣品50 μg加緩沖液煮沸變性后，10%SDS PAGE；電轉移至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉TBS (pH 8.0)封閉2 h；加入適量Bc1-2、Bax 鼠單抗IgG (1∶400)、Caspase-3兔多抗IgG(1∶400)，搖床上室溫反應2 h；洗膜3次，每次20 min；加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶6000)，室溫反應2 h；洗膜后作ECL化學發光，X光顯影。圖像掃描儀掃描后，用圖像分析軟件Band Scan 5.0行吸收度積分值分析，計算目的蛋白與內參照GAPDH蛋白表達量的吸收度積分值之比作為目的蛋白表達量相對含量，實驗重復3次。

結 果

1 大鼠佐劑關節炎模型的制備 致炎各組大鼠和正常大鼠相比，毛色晦暗并輕微脫毛，精神萎靡，食量減少，體重增長減緩，尾部出現明顯結節，雙側后踝關節出現明顯腫脹，造模成功，模型成功率達85%。模型組大鼠右后足在致炎后14 d出現腫脹，在致炎后28 d前后腫脹度達峰值見表1。與模型組比較，甲氨蝶呤顯示出劑量依賴性抑制大鼠足腫脹的作用，且模型組的足腫脹度越高，甲氨蝶呤的抑制作用越強，藥物在致炎后28 d左右抑制作用達到峰值，見圖1。其中，以高劑量最為明顯(P<0.01)，與對照組比較, 差異有統計學意義(P<0.05)，我們選擇其進行下面的實驗。

表1 甲氨蝶呤對Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)誘導大鼠足腫脹的抑制作用

圖1 甲氨蝶呤對Ⅱ型膠原蛋白誘導大鼠足腫脹的抑制作用

2 甲氨蝶呤對RA滑膜細胞凋亡的影響 細胞分離后培養48 h經Anziexin V/PI染色，用流式細胞術檢測各組凋亡細胞(圖2)，以右上和右下象限為凋亡細胞，統計各組凋亡細胞百分率。各組均能不同程度誘導RA滑膜細胞凋亡，以給藥組的作用最明顯。與對照組比較，模型組和假模型組明顯誘導RA滑膜凋亡(P<0.05)。

3 對大鼠關節滑膜細胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響 見圖3。高劑量甲氨蝶呤組的Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達量與模型組比較明顯上調；而與模型組相比較，Bc1-2蛋白表達量下降(P<0.01)。

假模型組 模型組 給藥組

圖3 線粒體凋亡途徑凋亡蛋白水平

討 論

RA是一種病變累及周圍關節的多系統性炎癥性的自身免疫病[5]。常因沒有早期診治，在發病兩年內出現不可逆的骨關節破壞，造成關節畸形以及功能喪失，最終殘疾[6]。有研究表明：類風濕關節炎的關節軟骨和骨組織損害，與滑膜細胞的過度增生活化與凋亡不足密切相關[1]。因此，抑制自身免疫反應的細胞增殖及促進該免疫反應的細胞凋亡，阻止關節滑膜中炎性細胞的浸潤可減輕關節炎病變，是治療關節炎的一條重要途徑。

甲氨喋吟是目前公認的治療RA有效的免疫抑制劑，通過對腺苷誘導的免疫抑制作用、對炎性細胞增殖和凋亡的影響及對單核細胞和淋巴細胞因子及其抑 制因子的作用等，以及使滑膜組織金屬蛋白酶水平降低，從而發揮抗炎及免疫抑制作用[7-9]。有研究表明：許多RA患者單用MTX即可使炎癥緩解，疾病活動性得到明顯的控制，且單藥治療除了極高的衛生經濟學價值外，還有相當好的安全性。Bologna等也對服用甲氨蝶吟的類風濕關節炎患者的長期隨訪研究發現患者的關節腫痛晨僵血沉及C-反應蛋白的指標在6個月左右開始顯著改善。本研究顯示：CIA大鼠造模后關節出現明顯腫脹，以后肢最為明顯，在第28天達到了高峰。進一步研究發現，治療后，高劑量治療組肢體炎癥的腫脹程度與模型組相比均有改善。結果表明MTX的應用對局部關節炎癥均有明顯控制作用，這與文獻報道相一致[10]。

我們的研究還發現治療組滑膜細胞的凋亡幅度明顯上升，與對照組差異顯著，進一步研究發現，模型組大鼠滑膜組織的Bcl-2表達增加，而Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達下降，提示滑膜細胞凋亡相關

基因表達異常，導致細胞增生與凋亡不平衡，從而引起滑膜細胞增生。而甲氨蝶呤使從大鼠滑膜細胞Bc1-2表達減少，Caspase-3、Caspase-9、Bax表達升高。提示甲氨蝶呤可能通過調控Bcl-2和Bax等凋亡相關基因，誘導RA滑膜細胞Caspase-3、9活化，促進滑膜細胞的凋亡，抑制關節滑膜細胞的增殖，減輕滑膜增厚而發揮治療作用。

總之，通過甲氨蝶呤對大鼠類風濕性關節炎模型滑膜細胞凋亡基因調控體內、體外的動物實驗研究，初證明了甲氨蝶呤對RA滑膜細胞有較強的誘導凋亡作用，為臨床上治療RA提供了實驗和理論依據，同時甲氨蝶呤在誘導RA滑膜細胞凋亡有非常復雜的作用機制，涉及體液、內分泌、免疫網絡中的多種調節因子、多種轉錄、代謝調控因素，故還需從其他相關基因或蛋白表達方面而做進一步研究。

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