胰頭癌患者腸系膜上動脈影像學邊界的病理學分析

魯 蒙 原春輝 張鈴福 彭 穎 陶連元 郭麗梅 修典榮

(北京大學第三醫院普通外科，北京 100191)

腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)的邊界特征與胰頭癌的可切除性及術后生存狀況密切相關[1～3]。可切除胰頭癌的診斷標準之一即為SMA未受腫瘤侵犯[3]，SMA切緣是胰頭癌切除標本中環周切緣的重要組成部分，其陽性與否是評估術后腫瘤復發風險的重要因素[4]。胰頭神經叢第Ⅱ部(plexus pancreaticus capitalis Ⅱ，PPC-Ⅱ)分布于SMA右側與胰腺鉤突之間，是胰頭癌最常見的胰腺外神經侵犯部位[5,6]，該部位神經侵犯可導致SMA切緣陽性，與術后腫瘤的早期復發有關，具有較差的預后[3,7,8]。

腹部增強CT在胰頭癌可切除性及胰腺外神經叢侵犯評估方面具有重要價值[9,10]。對于SMA未受侵犯的“可切除胰頭癌”，SMA的邊界在腹部增強CT中表現為不同特征。正常情況下，SMA周圍為清晰的脂肪密度影，提示無神經侵犯。SMA周圍脂肪密度影消失、被毛糙軟組織影替代被認為是胰頭神經叢侵犯的重要特征[11，12]。我科2016年以來常規收集胰頭癌患者的PPC-Ⅱ組織并在病理科行HE染色，分析該部位神經叢病變情況。與文獻報道不同，腹部增強CT中表現為毛糙SMA邊界的胰頭癌患者，病理結果提示PPC-Ⅱ神經侵犯發生率較低。Zhang等[13]研究認為胰頭癌內存在副交感神經增生現象，與腫瘤的出芽和預后有關。本研究對PPC-Ⅱ行免疫組化染色分析，旨在探究SMA的影像學邊界特征與PPC-Ⅱ中副交感神經增生之間的關系。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1～12月22例胰頭癌由我科同一手術醫師組施行開腹根治性胰十二指腸切除術作為研究對象。男10例，女12例。年齡45～81歲，(65±9)歲。術前CA19-9 0.6～5201.0 U/ml，中位數167.7 U/ml(我院正常值0～39 U/ml)。3例術中探查靜脈受侵，行腸系膜上靜脈或門靜脈切除重建術。術后電話、門診隨訪，隨訪截止2017年6月，隨訪時間1～18個月，中位隨訪時間10個月。所有患者的死亡均與腫瘤復發有關。

病例選擇標準：①術后病理證實為胰腺導管腺癌；②行開腹根治性胰十二指腸切除術，切除標本的總體切緣為鏡下切緣陰性(R0)或肉眼切緣陰性(R1)；③術前腹部增強CT判斷為SMA未受腫瘤侵犯的“可切除胰腺癌”。

病例排除標準：①其他病理類型胰頭及周圍腫瘤，如壺腹周圍癌、膽總管下段癌、胰腺導管內黏液癌、胰腺神經內分泌腫瘤等；②術中冰凍病理證實為肉眼切緣陽性(R2)，行全胰切除術；③術前腹部增強CT判斷為SMA受侵犯的“臨界可切除胰腺癌”。

1.2 方法

術前均行腹部增強CT檢查，采用德國Siemens公司64排螺旋CT儀器，掃描層厚為3 mm。觀察腹部增強CT動脈期內SMA自腹主動脈發出后4 cm走行區域內的組織層面，關注每個橫斷面上SMA周圍區域(主要為SMA右側180°范圍內血管與鉤突之間)的組織密度差異，并測量5 mm2范圍內的平均組織CT值。根據文獻[14]報道及臨床經驗，以-20 Hu為界，將病例分為SMA邊界清晰組和SMA邊界毛糙組。前者在SMA走行區域內邊界清晰，各層面CT值均低于-20 Hu，表現為脂肪密度影(圖1A)；后者在SMA走行區域呈現連續、不規則的稍高密度軟組織毛糙密度影，軟組織CT值大于-20 Hu(圖1B)。

胰十二指腸切除術中常規行PPC-Ⅱ清掃(圖2A)。術中探查SMA右側與鉤突之間的神經纖維組織，緊貼SMA右側仔細解剖，以絲線標記SMA根部的神經叢組織，將SMA的前方、右側和后方完整游離，從而將胰腺鉤突部以及PPC-Ⅱ自SMA右側壁完整銳性分離，達到骨骼化SMA右側壁的效果(圖2B)。將PPC-Ⅱ距鉤突邊緣約5 mm處平行離斷，自SMA根部開始，每隔1 cm切取組織，分別獲得距SMA根部1～4 cm處的神經組織。每塊神經叢組織塊大小約2 mm×2 mm×2 mm，行石蠟包埋制成切片。

對石蠟切片分別進行HE染色、免疫組化染色。免疫組化染色采用抗囊泡乙酰膽堿轉運體的兔多克隆抗體(VAChT，1∶100，ab-68984；Abcam，CA，USA)作為第一抗體。將石蠟切片使用二甲苯進行脫蠟及再次水化處理，通過浸潤在高壓滅菌器內10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中進行抗原修復。此后經3%過氧化氫及甲醛處理封閉內源性過氧化物酶活性，使用1%牛血清白蛋白阻止非特異性結合。然后加入VAChT進行孵育，置于4 ℃冰箱內過夜。經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫后，依次加入生物酰化的第二抗體、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復合物孵育。在3,3-二氨基聯苯胺中浸泡6 min，經10%蘇木精復染，脫水后封片。陰性對照以PBS液代替第一抗體(VAChT)。此后切片經病理科醫師分析取得染色結果。

1.3 觀察指標

主要觀察指標包括病理學和早期預后指標。

病理學指標：HE染色常規描述PPC-Ⅱ的主要構成成分、腫瘤神經侵犯情況。免疫組化染色主要分析PPC-Ⅱ中副交感神經增生情況。計數同一病例在距離SMA不同距離的4個標記處PPC-Ⅱ內副交感神經纖維數目，以其總和作為該病例最終的副交感神經纖維數目。同時收集腫瘤主體的病理結果，包括腫瘤大小、淋巴結轉移數目、脈管內癌栓、神經侵犯、腫瘤分化程度等。

術后腫瘤分期采用2016年發布的AJCC第8版分期系統[15]。Matsumoto等[16]報道根治性手術后6個月內腫瘤復發的胰腺癌，生存期8～9個月，5年生存率幾乎為0，故本研究統計術后6個月內的生存及腫瘤復發情況作為早期死亡及復發指標。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 臨床病理學特征

SMA邊界清晰組9例，男3例，女6例。年齡(65.7±8.7)歲。SMA右側區域組織動脈期CT值平均-53.4 Hu(-86.4～-23.9 Hu)。術前CA19-99.7～5201.0 U/ml，中位數153.4 U/ml。無術中聯合血管切除重建。低分化腺癌2例，其余7例為高分化和中分化腺癌；R1切除6例，其余3例R0切除；SMA切緣陽性3例；腫瘤內神經侵犯及脈管癌栓分別為8、2例。腫瘤最大徑為(3.2±1.2)cm，pT38例，pN14例，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別為4、5、0例。無早期死亡及復發。

SMA邊界毛糙組13例，男7例，女6例。年齡(65.2±10.0)歲。SMA右側區域組織動脈期CT值平均-11.4 Hu(-15.7～53.0 Hu)。術前CA19-9 0.6～1914.0 U/ml，中位數234.9 U/ml。術中聯合血管切除重建3例。低分化腺癌10例，其余3例高分化和中分化腺癌；R1切除8例，其余5例R0切除；SMA切緣陽性3例；腫瘤內神經侵犯及脈管癌栓分別12、4例。腫瘤最大徑(3.1±1.4)cm，pT36例，pN16例，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別為2、6、5例。早期死亡6例，早期復發4例。

2組患者年齡、性別、CA19-9、聯合血管切除、腫瘤大小、T分期、N分期、AJCC分期、R1切除、SMA切緣陽性、神經侵犯、脈管癌栓、早期復發等臨床病理學特征均無統計學差異(P>0.05)，腫瘤分化程度(P=0.027)、早期死亡(P=0.046)存在顯著差異。低分化腺癌和術后早期死亡在SMA邊界毛糙患者中比例更高(表1)。

2.2 PPC-Ⅱ病理學分析

PPC-Ⅱ的HE染色結果顯示僅1例存在該部位的神經侵犯現象，CT上表現為毛糙的SMA邊界,其余患者在HE染色切片中僅發現不同形狀特征的神經纖維，并未見神經侵犯。2組患者PPC-Ⅱ神經侵犯上無顯著差異性(P=1.000)

100倍光學顯微鏡下免疫組化染色后的PPC-Ⅱ呈現不同形狀及斷面的特殊染色的副交感神經纖維，在不同患者中分布密集程度不同(圖3)。22例PPC-Ⅱ中副交感神經纖維數目為5～60條，(23.3±14.4)條，其中SMA邊界清晰組患者副交感神經纖維數目為(14.8±4.0)條，SMA邊界毛糙組患者副交感神經纖維數目為(29.2±16.1)條。不同SMA邊界特征之間PPC-Ⅱ中副交感神經纖維數目存在顯著差異(P=0.017)，SMA邊界清晰者副交感神經纖維數目顯著少于SMA邊界毛糙者(表1)。

3 討論

胰頭癌是惡性程度極高的消化道腫瘤，以切除率低、術后復發死亡率高為主要特征，預后極差。部分胰頭癌患者行根治性胰十二指腸切除術后仍舊出現早期復發或死亡，表明胰頭癌的生物學行為存在多樣性。目前，胰頭癌的惡性程度可通過切除標本的病理學檢查進行判斷，根據腫瘤侵犯范圍、腫瘤大小、淋巴結和臟器轉移情況等進行腫瘤分期。神經侵犯是判斷胰頭癌預后的重要指標。PPC-Ⅱ自SMA右側神經節發出，神經纖維向胰腺鉤突側走行，主要分布在SMA自腹腔干根部發出后3～4 cm范圍內的右側區域，是胰頭癌最常見的胰腺外神經侵犯部位，也是胰腺癌術后復發及死亡的重要原因[17]。在腹部增強CT中，SMA右側正常的脂肪密度影消失、被軟組織密度影替代被認為是該部位神經叢存在腫瘤侵犯的影像學特征[11，12，18]，可通過術前腹部增強CT檢查中SMA周圍邊界特征來判斷是否存在胰腺外神經侵犯，從而預測胰頭癌的生物學行為。但本組單獨送檢的PPC-Ⅱ組織術后病理分析表明毛糙的SMA邊界與PPC-Ⅱ神經侵犯并非完全對應，與文獻[11，12]報道矛盾，提示在術前腹部增強CT中，毛糙的SMA邊界可能預示PPC-Ⅱ的其他病理學變化。

圖1 SMA邊界的CT影像學特征 A. 病例1，胰頭癌，男，56歲。腹部增強CT動脈期顯示胰頭部腫瘤(虛線框內)位于鉤突，SMA(短箭頭)周圍為清晰的脂肪密度影(長箭頭)；B. 病例2，胰頭癌，女，63歲。腹部增強CT動脈期顯示胰頭部腫瘤(虛線框內)位于鉤突，SMA(短箭頭)右側可見區別于脂肪密度的毛糙狀組織陰影(長箭頭) 圖2 PPC-Ⅱ神經取材示意圖 A.胰腺鉤突移除后，血管拉鉤將SMV拉至左側，顯露出SMA右側壁,將PPC-Ⅱ組織自SMA右側壁銳性剝離；B．SMA右側壁骨骼化后手術創面(SMA：腸系膜上動脈；SMV：腸系膜上靜脈；IVC：下腔靜脈；黑色箭頭：胰腺斷面) 圖3 副交感神經纖維經免疫組化染色后呈黃色深染結構 A.病例1低倍鏡視野(×10)可見副交感神經聚集區域少;B.A中方框內區域在高倍鏡視野(×100)下可見副交感神經纖維分布稀疏(箭頭)，神經周圍可見空泡狀脂肪結構。C.病例2低倍鏡視野(×10)可見副交感神經聚集區域多;D.C中方框內區域在高倍鏡視野(×100)下可見副交感神經纖維分布密集，呈不同形態及斷面

組別年齡(歲)性別男女CA19-9(U/ml)*聯合血管切除神經侵犯脈管內癌栓SMA邊界清晰組(n=9)65.7±8.736153.4(9.7～5201.0)082SMA邊界毛糙組(n=13)65.2±10.076234.9(0.6～1914.0)3124t(χ2,Z)值t=0.021Z=-0.334P值0.9050.415**0.7440.240**1.000**1.000**組別PPC-Ⅱ腫瘤侵犯(例)PPC-Ⅱ副交感神經纖維(條)腫瘤最大徑(cm)pT3pN1SMA邊界清晰組(n=9)014.8±4.03.2±1.284SMA邊界毛糙組(n=13)129.2±16.13.1±1.466t(χ2,Z)值t=-2.610t=0.174P值1.000**0.0170.8630.074**1.000**組別AJCC分期(例)123低分化腺癌(例)總體切緣陽性(例)SMA切緣陽性(例)早期死亡(例)早期復發(例)SMA邊界清晰組(n=9)45026300SMA邊界毛糙組(n=13)265108364t(χ2,Z)值χ2=5.202P值0.0740.027**1.000**0.655**0.046**0.115**

*數據偏態分布，用中位數(最大值～最小值)表示

**Fisher精確檢驗

副交感神經增生是胰頭癌腫瘤微環境內的一種形態學現象，表現為副交感神經纖維在腫瘤基質內的分布，可發生在腫瘤內、胰腺內或胰腺外等。胰頭癌存在不同程度的副交感神經增生現象，可能誘導腫瘤出芽，繼而導致腫瘤的復發、播散行為[13]。在SMA切緣部位的神經叢亦容易發生腫瘤出芽，導致遠處轉移[19]。因此，副交感神經增生可能與胰頭癌的腫瘤出芽現象有關，易引發胰頭癌的復發、播散、遠處轉移等，是潛在反映胰頭癌生物學行為的指標。故本研究對位于SMA切緣部位的PPC-Ⅱ進行副交感神經的免疫組化染色，探究該部位神經叢是否存在副交感神經增生現象。病理分析結果表明，所有患者的PPC-Ⅱ標本中均存在不同程度的副交感神經增生，SMA邊界清晰患者PPC-Ⅱ中副交感神經纖維數目為(14.8±4.0)條，顯著少于SMA邊界毛糙患者(29.2±16.1)條，不同SMA邊界特征PPC-Ⅱ中副交感神經增生程度具有明顯差異性(P=0.017)，提示副交感神經增生活躍是腹部增強CT中SMA邊界毛糙的可能原因。

自主神經系統(交感神經、副交感神經)在胰腺癌中的作用已有相關研究闡述。神經增生不僅指神經纖維在胰腺外的分布生長[13]，也反映腫瘤細胞與神經纖維之間的相互促進作用。腫瘤處于新生長的自主神經纖維網絡中，可引起神經病變或“神經重塑”，其病變類型多樣，包括神經增生、神經增殖、神經炎癥及常見的神經侵犯等[20～22]。本研究中SMA邊界毛糙者PPC-Ⅱ發生神經侵犯的概率較低(7.7%，1/13)，但存在較活躍的副交感神經增生現象，副交感神經纖維數目顯著高于SMA邊界清晰者，表明神經增生與神經侵犯可能均為胰腺癌神經病變的類型，在不同患者中存在不同的表達方式。另外，神經纖維的生長同樣可以調節腫瘤的生長出芽，在腫瘤由局部到遠處轉移的過程中發揮重要作用，與腫瘤復發轉移密切關聯。SMA邊界毛糙組術后早期病死率(46.2%，6/13)明顯高于SMA邊界清晰組(0%，0/9)(P=0.046)。2組腫瘤分化程度也存在明顯差異(P=0.027)，低分化腺癌在SMA邊界毛糙者中的比例更高,提示毛糙的SMA邊界可能預示更差的預后和更高的腫瘤惡性程度。

PPC-Ⅱ的病理研究有助于發現胰頭癌早期復發轉移的機制，了解神經病變在調控腫瘤出芽、播散中的作用。同時，研究SMA在術前影像學中的邊界特征與PPC-Ⅱ病理結果的關系，有助于術前對胰頭癌患者進行預后分層，對患者進行更好的治療決策。對于SMA邊界毛糙的患者，根治性手術可能不會給患者預后帶來收益，術前新輔助治療或其他治療方案是潛在的治療方案，但需要進一步研究[8,23]。

本研究存在一些不足。首先，樣本數較少，無法進行多因素分析，故無法判斷SMA邊界特征與各臨床病理學特征有無相關性，預后分析也存在一定限制，需要進一步擴大樣本數目行免疫組化染色。其次，在PPC-Ⅱ的免疫組化染色分析中，缺乏正常人對照結果，無法對比SMA邊界清晰組與正常人是否存在副交感神經增生程度的差別。后期可通過尸體解剖研究獲得相關證據。同時，副交感神經纖維粗細、神經纖維周圍淋巴細胞增生、交感神經增生等其他病理特征仍需要進一步染色分析。

總之，術前腹部增強CT中SMA邊界毛糙現象不限于胰頭神經叢的腫瘤侵犯，還預示其他類型神經病變，例如活躍的副交感神經增生等，這些特征均與較差的預后有潛在的關聯。進一步對PPC-Ⅱ進行多種免疫組化染色分析、擴大樣本量，探究其他可能的神經病變與腫瘤進展的關系，對明確胰頭癌腫瘤復發轉移機制，探索新的治療方案都有重大的意義。

1 Balaban EP, Mangu PB, Khorana AA, et al. Locally Advanced, Unresectable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline. J Clin Oncol,2016,34(22):2654-2668.

2 Sohal DP, Mangu PB, Khorana AA, et al. Metastatic Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline. J Clin Oncol,2016,34(22):2784-2796.

3 Khorana AA, Mangu PB, Berlin J, et al. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline. J Clin Oncol,2016,34(22):2541-2556.

4 Peng Y, Xiu D, Jiang B, et al. A clinical study about applying different R1 criteria to evaluate pancreatic head ductal adenocarcinoma specimens. Chin J Surg,2014,52(11):834-838.

5 Patel BN, Giacomini C, Jeffrey RB, et al. Three-dimensional volume-rendered multidetector CT imaging of the posterior inferior pancreaticoduodenal artery: its anatomy and role in diagnosing extrapancreatic perineural invasion. Cancer Imaging,2013,13(4):580-590.

6 Zuo H. CT and MR imaging patterns for pancreatic carcinoma invading the extrapancreatic neural plexus (PartⅠ): Anatomy, imaging of the extrapancreatic nerve. World J Radiol,2012,4(2):36-43.

7 彭 穎,修典榮,馬朝來,等.胰頭癌胰十二指腸切除術切緣癌細胞殘留(R1)的研究和對臨床實踐的啟示.中國微創外科雜志,2012,12(7):608-611.

8 Hirono S, Kawai M, Okada K I, et al. Treatment strategy for borderline resectable pancreatic cancer with radiographic artery involvement. Pancreas, 2016,45(10):1438-1446.

9 Yu Y, Guo M, Han X. Comparison of multi-slice computed tomographic angiography and dual-source computed tomographic angiography in resectability evaluation of pancreatic carcinoma. Cell Biochem Biophys,2014, 70(2):1351-1356.

10 Allen VB, Gurusamy KS, Takwoingi Y, et al. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database Syst Rev,2013,11(1):CD009323.

11 Kim JH, Eun HW, Kim KW, et al. Diagnostic performance of MDCT for predicting important prognostic factors in pancreatic cancer. Pancreas,2013, 42(8):1316-1322.

12 Zuo H. CT and MR imaging patterns for pancreatic carcinoma invading the extrapancreatic neural plexus (Part Ⅱ): Imaging of pancreatic carcinoma nerve invasion. World J Radiol,2012,4(1):13-20.

13 Zhang L, Guo L, Tao M, et al. Parasympathetic neurogenesis is strongly associated with tumor budding and correlates with an adverse prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Chin J Cancer Res,2016,28(2):180-186.

14 Parikh AM, Coletta AM, Yu ZH, et al. Development and validation of a rapid and robust method to determine visceral adipose tissue volume using computed tomography images. PLoS One,2017,12(8):e0183515.

15 楊尹默.AJCC第八版及日本胰腺學會第七版胰腺癌TNM分期的更新要點及內容評價.中華外科雜志,2017,55(1):20-23.

16 Matsumoto I, Murakami Y, Shinzeki M, et al. Proposed preoperative risk factors for early recurrence in patients with resectable pancreatic ductal adenocarcinoma after surgical resection: A multi-center retrospective study. Pancreatology,2015,15(6):674-680.

17 Liang D, Shi S, Xu J, et al. New insights into perineural invasion of pancreatic cancer: More than pain. Biochim Biophys Acta,2016, 1865(2):111-122.

18 Deshmukh SD, Willmann JK, Jeffrey RB. Pathways of extrapancreatic perineural invasion by pancreatic adenocarcinoma: evaluation with 3D volume-rendered MDCT imaging. Am J Roentgenol,2010,194(3):668-674.

19 Liu DN, Lv A, Tian ZH, et al. Superior mesenteric artery margin in pancreaticoduodenectomy for pancreatic adenocarcinoma. Oncotarget,2017, 8(5):7766-7776.

20 Jobling P, Pundavela J, Oliveira SM, et al. Nerve-cancer cell cross-talk: a novel promoter of tumor progression. Cancer Res,2015,75(9):1777-1781.

21 Guo K, Ma Q, Li J, et al. Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling. Mol Cancer Ther,2013,12(3):264-273.

22 Demir IE, Friess H, Ceyhan GO. Nerve-cancer interactions in the stromal biology of pancreatic cancer. Front Physiol,2012,3：97.

23 Takahashi H, Ohigashi H, Ishikawa O, et al. Perineural invasion and lymph node involvement as indicators of surgical outcome and pattern of recurrence in the setting of preoperative gemcitabine-based chemoradiation therapy for resectable pancreatic cancer. Ann Surg,2012,255(1):95-102.