鹿角形腎結(jié)石尿路感染患者腎內(nèi)Osteopontin的表達(dá)意義

楊 立，楊銀桂，肖玉坤，李正金，李照坤

（大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

鹿角形腎結(jié)石定義為結(jié)石位于腎盂且分支進(jìn)入腎盞〔1〕，此類鹿角形腎結(jié)石常較為復(fù)雜并伴有尿路感染、且有難以取凈和術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點。大理地區(qū)為鹿角形腎結(jié)石高發(fā)地區(qū)，探討鹿角形腎結(jié)石伴有尿路感染的發(fā)病因素和機制對于這類復(fù)雜性腎結(jié)石的預(yù)防和治療具有積極意義。

1 資料與方法

1.1 納入病例納入2015年3月至2017年2月在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科診斷為鹿角形腎結(jié)石伴有尿路感染病例30例（1組）和單純鹿角形上尿路結(jié)石表征不伴有尿路感染病例30例（2組）患者。關(guān)于尿路感染患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①尿路中段尿培養(yǎng)結(jié)果陽性；②尿常規(guī)中檢測白細(xì)胞（++）以上；③尿常規(guī)中亞硝酸鹽（+）以上，需同時滿足上述3個條件中的2個；非尿路感染性患者組需上述3個檢測指標(biāo)條件均不滿足后納入研究組。1組患者年齡25～60歲，平均（38.16±15.94）歲，其中男性患者17人，女性患者13人，行腎臟、輸尿管、膀胱平片和靜脈泌尿系統(tǒng)成像（KUB+IVU）檢查中所測量結(jié)石直徑平均約（2.95±0.34）cm；2組患者年齡23～65歲，平均（38.20±14.06）歲，其中男性患者14人，女性患者16人，行KUB+IVU檢查中所測量結(jié)石直徑平均約（2.02±0.18）cm。兩組患者均無伴隨腫瘤性疾病。兩組患者一般資料比較，行配對t檢驗提示兩組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.94＞0.05），結(jié)石直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.47＞0.05）。所有患者均通過術(shù)前評估存在手術(shù)指征，充分術(shù)前準(zhǔn)備后行經(jīng)皮腎鏡碎石術(shù)。術(shù)后3 d內(nèi)上述所有患者再次檢測尿常規(guī)和送中段尿培養(yǎng)。

1.2 標(biāo)本采集行B超引導(dǎo)下經(jīng)皮腎鏡碎石并清石后，在確?；颊呱w征平穩(wěn)和腎鏡視野清楚的情況下，觀察各組病例中腎結(jié)石或腎結(jié)石分支所在腎盂、腎盞粘膜區(qū)域及非結(jié)石所分布的集合系統(tǒng)黏膜區(qū)域的大體病理變化、腎乳頭及周圍組織情況。1組病例中可于內(nèi)鏡下觀察，如有病理改變區(qū)域（尤其是結(jié)石分支所在區(qū)域黏膜異常改變），用5F活檢鉗行選擇性取材，分別夾取活組織送檢（定義為1組a區(qū)）；于結(jié)石分支未分布的集合系統(tǒng)黏膜區(qū)域同法夾取活組織送檢（定義為1組b區(qū)）。2組病例中于結(jié)石所停留腎盂、腎盞和輸尿管上段周圍黏膜中取材，同法夾取活組織送檢（定義為2組a區(qū)）；于腎內(nèi)結(jié)石未分布的集合系統(tǒng)黏膜區(qū)域同法夾取活組織送檢（定義為2組b區(qū)）。

仔細(xì)檢查所有活檢部位有明顯活動出血者用鈥激光或等離子電極電凝止血，檢查無出血后常規(guī)留置腎造瘺管，術(shù)后腎造瘺管夾管4 h，開放腎造瘺管后密切觀察尿色情況。

1.3 組織病理觀察及OPN檢測各組各區(qū)活檢組織用中性甲醛固定后，石蠟包埋切片后等分2份；其中1∕2作HE染色后觀察局部組織病理，另1∕2標(biāo)本行OPN免疫組化檢測（用免疫組化SABC法進(jìn)行，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，OPN生產(chǎn)廠家：南京森貝伽生物科技有限公司；試劑盒編號：SBJ-H0080）。由兩名病理科醫(yī)生行雙盲法閱片，首先低倍鏡（×40）下觀察全片Osteopontin表達(dá)情況，然后高倍視野（×400）下進(jìn)行觀察。采用雙評分半定量法進(jìn)行評分（即根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行判定）：不著色，0分；黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。陽性細(xì)胞所占視野細(xì)胞比例的評定標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞率≤10%，0分；10%～25%，1分；25%～50%，2分；＞50%，3分。2項評分相加：0～1分為陰性（-）；≥2分為陽性（+）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理比較各組各區(qū)中OPN表達(dá)結(jié)果，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間率的比較用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎局部病理特征1組部分患者（約23∕30=76.7%）行經(jīng)皮腎鏡碎石手術(shù)過程中可在內(nèi)鏡下觀察到結(jié)石所在腎盞局部的大體病理特征，如鈣鹽沉積、結(jié)晶顆粒黏附或“菌斑”殘留等。2組患者病例在手術(shù)中觀察到少部分（4∕30=13.3%）有上述大體病理特征改變。見圖1。

其中在1組患者病例中，中段尿培養(yǎng)陽性和鹿角形腎結(jié)石所在區(qū)域“病理征陽性”有20例患者，2例患者中段尿培養(yǎng)陽性而鹿角形腎結(jié)石所在區(qū)域病理征陰性，3例患者鹿角形腎結(jié)石所在區(qū)域病理征陽性而中段尿培養(yǎng)陰性，5例患者上述兩者結(jié)果均為陰性。用χ2檢驗相關(guān)性分析將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在鹿角形腎結(jié)石的病例中，中段尿培養(yǎng)與結(jié)石所在集合系統(tǒng)黏膜“病理征”存在相關(guān)，中段尿培養(yǎng)陽性幾率增加，其結(jié)石所在集合系統(tǒng)黏膜“病理征”陽性率較大（χ2=9.043，P=0.003），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 鈣鹽沉積及菌斑殘留

2.2 標(biāo)本HE染色觀察1組病例中部分標(biāo)本的HE染色可見鈣鹽結(jié)晶分布，但2組病例中則較少觀察到鈣鹽結(jié)晶分布。兩組標(biāo)本組織視野中鈣鹽結(jié)晶陽性出現(xiàn)率分別為1a區(qū)76.70%（23∕30），1b區(qū) 13.30%（4∕30），2a區(qū) 6.7%（2∕30），2b區(qū) 0.0%（0∕30）。鈣鹽結(jié)晶的分布主要與鹿角形腎結(jié)石組及所在局部區(qū)域相關(guān)。

2.3 標(biāo)本中OPN的表達(dá)1組a區(qū)，2組a區(qū)中所取標(biāo)本活檢行OPN檢測分別可見有22例（22∕30）和2（2∕30）呈陽性表達(dá)。各組OPN表達(dá)情況比較見表1，圖2。

圖2OPN表達(dá)

上述數(shù)據(jù)表明1組鹿角形腎結(jié)石伴有尿路感染的病例中結(jié)石所在區(qū)域腎盞黏膜的OPN呈現(xiàn)高表達(dá)，即使結(jié)石未分布伸入的腎盞仍有一定程度表達(dá)。而2組病例中不管是結(jié)石所在區(qū)域及非結(jié)石分布區(qū)域的集合系統(tǒng)黏膜中都較少有OPN表達(dá)。

表1 各組各區(qū)中OPN陽性表達(dá)情況比較

3 討論

經(jīng)典的腎鈣斑理論是尿石癥發(fā)病機制中最重要的假說。學(xué)者Randall首先描述了腎乳頭表面潛在的腎鈣斑，這種斑塊位于腎乳頭上皮下的內(nèi)髓間質(zhì)，并據(jù)此提出了結(jié)石附著于腎鈣斑生長的假說，而附著于腎鈣斑生長的結(jié)石外表部分凹陷呈臍形且成分為羥磷灰石。根據(jù)Evan等學(xué)者對8類病因的結(jié)石患者的研究結(jié)果，結(jié)石的初始生長位置分為兩類，一類是腎鈣斑，另一類是位于Bellini集合管內(nèi)的鈣鹽沉積（腎鈣栓，Randallplug）〔2〕。不論是腎鈣斑還是Randallplug，其都作為結(jié)晶物質(zhì)形成的初始部位，在各種大分子或蛋白調(diào)控下進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)石生成并在感染因素誘導(dǎo)下加速這一過程〔3〕。

鹿角形腎結(jié)石通常含有磷酸胺鎂和碳酸鈣∕磷灰石成分，而磷酸銨鎂結(jié)石類型主要由尿路中能產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌所致，屬于感染性結(jié)石的范疇〔4〕。感染是導(dǎo)致鳥糞樣鹿角形腎結(jié)石（磷酸胺鎂為主）形成的重要因素，這個觀點和認(rèn)識早已成定論且為學(xué)界公認(rèn)。而最近研究表明實際上細(xì)菌在草酸鈣和磷酸鈣等為主要成分的結(jié)石形成過程中作用更為突出，其可促進(jìn)蛋白合成進(jìn)而形成結(jié)石基質(zhì)〔5〕。因此不論鹿角形腎結(jié)石的成分如何，感染在促進(jìn)結(jié)石生成過程中都至關(guān)重要。在臨床中，這類患者的尿常規(guī)和尿培養(yǎng)結(jié)果常提示有感染存在。本組鹿角形腎結(jié)石患者于內(nèi)鏡條件下觀察，可在結(jié)石局部生成的部位看到有“菌斑”形成，這種“菌斑”類似口腔牙或黏膜表面附著的“細(xì)菌集落”病變，其是指基質(zhì)包裹的互相粘附、或粘附于表面的軟而未礦化的細(xì)菌性群體，是一種細(xì)菌性生物膜。而這些牙菌斑可能導(dǎo)致形成牙結(jié)石或結(jié)垢〔6〕。而本組病例觀察結(jié)果亦提示“菌斑”征出現(xiàn)區(qū)域主要與鹿角形結(jié)石分布有關(guān)。

Osteopontin（OPN）是一種非膠原性骨基質(zhì)的機體反應(yīng)蛋白，廣泛分布于機體的多種組織和細(xì)胞中，其可在腎小管的上皮細(xì)胞表達(dá)且易受機體的水合狀態(tài)影響〔7〕。作為一種多功能介導(dǎo)因子，其常常在應(yīng)激反應(yīng)途徑中出現(xiàn)，在感染環(huán)境中其表達(dá)水平顯著增加〔8〕。其可能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生和釋放可溶性尿激酶型纖溶酶原激活物受體（soluble urokinase-type plasminogen activator receptor，suPAR）來反饋作用于機體〔9〕，而suPAR與腎臟慢性疾病及損傷有關(guān)〔10〕。近年來的研究表明，腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷在誘導(dǎo)和調(diào)控結(jié)石形成過程中起到重要作用〔11〕。腎小管上皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致合成并分泌某些基質(zhì)蛋白，或通過分泌特異的炎性因子促使局部結(jié)晶物質(zhì)較易附著，這些特殊蛋白成分中以O(shè)PN較為顯著。而國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)OPN可使巨噬細(xì)胞將結(jié)石晶體轉(zhuǎn)運至髓袢基底膜處，從而成為Randall斑的起源〔12〕。

本組標(biāo)本檢測結(jié)果顯示，在鹿角形腎結(jié)石伴有尿路感染病例中骨橋蛋白呈顯著表達(dá)，且高于單純鹿角形腎結(jié)石組，且這種顯著表達(dá)與“菌斑”分布存在有關(guān)聯(lián)。在我們臨床隨訪中，尿培養(yǎng)出大腸埃希菌陽性患者多為復(fù)發(fā)性鹿角形結(jié)石。國外研究顯示大腸埃希菌所致泌尿系感染可誘導(dǎo)腎小管上皮粘膜損傷，導(dǎo)致骨橋蛋白高表達(dá)后促使結(jié)晶成核、滯留較易，最終使結(jié)石生成〔13〕。結(jié)合我們的觀察結(jié)果，推測作為介導(dǎo)腎小管上皮損傷的蛋白分子OPN較易導(dǎo)致感染性鹿角形結(jié)石的形成，且這類結(jié)石往往容易在干預(yù)后復(fù)發(fā)。分析原因可能為腎小管上皮黏膜損傷在初次干預(yù)或外科術(shù)后存在，其術(shù)后泌尿系感染幾率增加情況下致OPN的高表達(dá)，從而加速了結(jié)石形成致復(fù)發(fā)這一過程，但具體機制仍需進(jìn)一步探討。在本組鹿角形腎結(jié)石伴有尿路感染病例中檢測出的菌群依次為大腸埃希菌和奇異變形桿菌，而近來研究表明OPN可通過免疫調(diào)節(jié)機制導(dǎo)致機體局部炎癥狀態(tài)細(xì)菌菌群的紊亂〔14〕。因此對于鹿角形腎結(jié)石患者伴隨明顯局部感染和腎小管上皮黏膜損傷，在上述條件下OPN的調(diào)節(jié)效應(yīng)在某種程度上是加速的，這或許為臨床上部分復(fù)雜鹿角形腎結(jié)石患者術(shù)后較快復(fù)發(fā)提供治療和預(yù)防復(fù)發(fā)的干預(yù)思路。

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