PPARα調控SOD2表達的機制研究

楊錫彤，秦 燕，杜小珊，徐弘揚，王光明*

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.大理大學第一附屬醫院，云南大理 671000）

PPAR（過氧化物酶體增殖物激活受體）是一類由配體激活的核轉錄因子，屬于核激素受體超家族成員之一，包括α，β，γ 3種亞型，均具有調節靶基因表達的功能〔1〕。非諾貝特是PPARα的配體，因能降低甘油三脂和膽固醇而在臨床上作為降脂藥物廣泛使用〔2〕。而近年研究表明，貝特類藥物除降脂作用外，還是PPARα的激動劑〔3〕。PPARα的配體包括Clofibrate、Gemfibrozil、Wy14634和非諾貝特等，除了降脂作用外還有抗炎和抗氧化作用等〔4〕。SODs是ROS（活性氧）防御系統中最原始也是最重要的抗氧化酶〔5〕。SODs 包括SOD1（Cu∕Zn-SOD）、SOD2（Mn-SOD）、SOD3（ecSOD）3種亞型，其中SOD2作為輔因子存在于需氧細胞的線粒體內，其物理結構由5個外顯子和4個內含子構成。SOD2以同源四聚體存在，在促進細胞分化和腫瘤發生過程中起重要的作用，并能防止氧過多而引起的肺毒性作用〔6〕。

前期研究表明，小鼠在腦缺血狀態下，SODs的表達下降，但經過PPARα的激動劑非諾貝特或Wy14643處理后，SODs表達明顯升高〔7-8〕，從而非諾貝特和Wy14643能起到保護神經的作用，但是目前非諾貝特或Wy14643如何影響SODs的表達其機制尚不清楚。因此在2013年3月至2016年5月本研究通過在細胞水平，利用培養的BMEC經非諾貝特處理后，用實時熒光定量PCR的方法檢測非諾貝特是否影響PPARα和SOD2的表達；利用C57BL∕6小鼠經非諾貝特處理，分離腦微血管，用實時熒光定量PCR的方法檢測非諾貝特是否在動物水平影響PPARα和SOD2的表達；用pGL4 mSOD2（含SOD2基因啟動子序列）或pGL4 mu mSOD2（含SOD2基因啟動子中PPRE結合區域突變）熒光素酶報告質粒，BMEC經過轉染后用非諾貝特處理，檢測BMEC中的熒光素酶活性，以研究非諾貝特如何調節SOD2的表達。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑15只6～8周齡的雄性C57BL∕6小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK2016（湘）0002）；CMC（羧甲基纖維素，Sigma公司）；DMSO（二甲基亞砜，Sigma公司）；非諾貝特（Sigma公司）；lipofectamine2000引物合成，總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒和定點突變試劑盒均由Invitrogen公司（Carlsbad，CA）提供，實時熒光定量PCR試劑盒購自Bio-Rad公司（Richmond，CA），熒光素酶報告系統購自Promega公司（Madison，WI），BMEC細胞購自北京鈞堯偉業生物科技有限公司（CRL-3245），其余試劑未作特殊說明均來自Sigma公司。

1.2 細胞培養及非諾貝特處理BMEC生長在含10%的胎牛血清、100 IU∕mL青霉素和鏈霉素的F12培養基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，每3～4天傳代1次，5～6代用于實驗。細胞傳代后，當細胞生長到培養皿底部的70%～80%，換不含血清和雙抗的F12培養基過夜處理，第2天加入終濃度為10 μg∕mL的非諾貝特（溶解于DMSO中）處理12 h（實驗組），對照組用同等體積的DMSO處理。收獲細胞，提取總RNA。

1.3 C57BL∕6小鼠的處理雄性C57BL∕6小鼠購買回來后，隨機分為2組，實驗組7只，在試驗中給予Feno干預；對照組（8只）用制作非諾貝特混懸液的試劑CMC處理。為適應環境，在大理大學動物中心飼養1周，然后灌胃給藥，分別給予30 mg∕kg Feno、10 mL∕kg 5%CMC混懸液處理，連續給藥7 d，每次給藥時間均控制在上午8：00—8：30間。在第7天給藥30 min內處死小鼠，取腦組織置于4℃的PBS（pH 7.4）中分離腦微血管用于后續實驗。

1.4 腦微血管的分離按照參照文獻〔7〕介紹的方法分離小鼠腦微血管，上述腦組織去除腦膜后在3 mL的0.1 mol∕L PBS中勻漿，4 ℃、2 000 g離心5 min，沉淀物用3 mL 0.1 mol∕L PBS混懸后在混懸液的上方加入5 mL的15%右旋糖苷溶液（0.1 mol∕L PBS配制）中，4℃、3 500 g離心35 min后，沉淀物用冷的0.1 mol∕L PBS混懸，過孔徑為40 μm的尼龍膜，收獲尼龍膜上方的部分即為腦微血管，提取總RNA。

1.5 實時熒光定量PCR檢測PPARα和SOD2的表達為了在細胞水平和動物水平闡明非諾貝特對SOD2表達的影響及是否激活PPARα，從非諾貝特處理的BMEC和非諾貝特處理的小鼠腦微血管提取總RNA，并反轉錄為cDNA。總RNA的提取和反轉錄總RNA為cDNA均依照Invitrogen公司的RNA提取試劑盒和cDNA合成試劑盒說明書進行，然后用Bio-Rad公司的iQ SYBR Green試劑盒進行檢測，反應體系為50 μL，其中cDNA 2 μL，SYBR Green混合物25 μL，引物各0.5 μL，其余用DEPC處理的水補齊50 μL。反應條件為95℃預變性10 min，然后95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，35個循環。PPARα、SOD2和內參18 s的引物序列見表1。

表1 PCR擴增及克隆用引物

1.6 含SOD2啟動子的熒光素酶報告質粒的構建通過網上數據庫：http：∕∕genome.ucsc.edu∕index.html，調取小鼠SOD2基因的啟動子序列，設計引物，用小鼠的基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物插入pGL4.10 Luciferase Reporter Vectors中，得到含SOD2啟動子序列的熒光素酶報告質粒pGL4mSOD2。

1.7 含SOD2啟動子的熒光素酶報告質粒的定點突變在1 633至1 660堿基序列中，有PPAR的結合位點；序列為cgttggGGTCagagtccccgttgtttct，根據該序列及突變試劑盒的說明書，設計用于突變的引物，然后利用點突變試劑盒，把GGTC突變為CCAG，插入pGL4 Luciferase Reporter Vectors中，可得到含突變的SOD2啟動子序列的熒光素酶報告質粒pGL4 mu mSOD2。

1.8 熒光素酶活性檢測為了闡明PPARα對SOD2表達的調節作用，以pGL4.74所攜帶的熒光素酶信號為內參，pGL4 mSOD2攜帶的信號為目的信號。為了排除細胞數量的差異，用內參信號對目的信號進行同一化處理。本研究用含SOD2啟動子序列的熒光素酶報告質粒pGL4 mSOD2與pGL4.74用lipofectamine2000共轉染BMEC，轉染24 h后用最終濃度為10 μg∕mL的非諾貝特處理12 h，收獲細胞后按照試劑盒說明檢測細胞中的熒光素酶活性；為了進一步研究PPARα通過與SOD2基因啟動子上的PPRE結合以調節SOD2的表達，本研究用pGL4 mu mSOD2與pGL4.74共轉染BMEC，24 h后經10 μg∕mL的非諾貝特處理12 h，收獲細胞檢測細胞中的熒光素酶活性。

1.9 統計學分析PPARα和SOD2 mRNA表達數據進行t檢驗，熒光素酶活性用SPSS 10.0統計軟件進行one-way ANOVA分析，并進行Scheffe post hoc統計學分析。

2 結果

2.1 BMEC中PPARα和SOD2的表達BMEC給予10 μg∕mL的非諾貝特刺激12 h后，提取總RNA，逆轉錄總RNA為cDNA，熒光定量PCR檢測結果表明PPARα和SOD2的表達明顯升高（P＜0.01）。見圖1～2。

BMEC給予非諾貝特處理12 h后，PPARα的表達升高；C57BL∕6經連續灌胃給非諾貝特7 d后，分離腦組織中的微血管成分，實時熒光定量PCR檢測PPARα的表達升高。

圖1 PPARα的表達圖

2.2 C57BL∕6小鼠腦微血管中PPARα和SOD2的表達C57BL∕6小鼠灌胃給予30 mg∕kg體重的非諾貝特處理7 d后，其腦微血管中PPARα和SOD2的表達明顯升高（P＜0.01）。見圖1～2。BMEC給予非諾貝特處理12 h后，SOD2的表達升高；C57BL∕6經連續灌胃給非諾貝特7 d后，分離腦組織中的微血管成分，實時熒光定量PCR檢測SOD2的表達升高。

圖2 SOD2的表達圖

2.3 熒光素酶活性變化BMEC轉染pGL4.74和pGL4 mSOD2或pGL4 mu mSOD2 24 h后，BMEC給予10 μg∕mL的非諾貝特處理12 h，測定熒光素酶的活性，結果發現非諾貝特能夠增強pGL4 mSOD2的活性（P＜0.01），但是把SOD2基因啟動子中PPRE結合序列的關鍵堿基突變后，即使給予非諾貝特刺激，pGL4 mu mSOD2的活性沒有明顯的改變。

BMEC共轉染pGL4.74和pGL4 mSOD2后，給予非諾貝特刺激，熒光素酶活性增強；當SOD2啟動子區與PPRE結合的關鍵堿基突變后，即使給予非諾貝特刺激，熒光素酶活性也并未改變。見圖3。

圖3 熒光素酶活性檢測圖

3 討論

PPARα主要分布在代謝活躍的組織中，例如肝臟、腎臟和心臟，其作用主要是調節脂肪酸的代謝〔9-10〕。另外，PPARα在腦組織中也廣泛表達，在小鼠I∕R（缺血∕再灌注）損傷中可以抑制NOX的表達和減少氧自由基ROS的含量〔11〕以保護由于I∕R引起的損傷。非諾貝特和Wy-14643，都作為PPARα的配體，能導致過氧化物酶體的增殖和肝臟腫大。近年來的研究表明PPARα可作為部分抗氧化酶的一種表達促進劑，例如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶（SODs）和抗炎介質〔12〕。

體內的ROS主要來源于還原型輔酶Ⅱ（NADPH oxidase）等的作用，而ROS的清除主要依賴于SODs〔13〕。有研究表明，在心臟、胃、小腸、腦、視網膜等組織缺血過程中，ROS的含量升高〔14-16〕。Boshra等〔17〕在研究肝臟缺血-再灌注損傷時發現非諾貝特可以促進SODs的表達以降低ROS含量而對肝臟缺血∕再灌注損傷進行保護；Ibarra-Lara等〔18〕在心肌缺血損傷時也發現非諾貝特的類似物Clofibrate也具有相似的功能；同樣的保護機制在其他臟器的缺血∕再灌注損傷的研究中得到進一步證實〔19-20〕，說明非諾貝特可能具有調節SODs表達的功能。而我們前期研究發現給予非諾貝特處理后，缺血小鼠腦組織中的ROS含量降低，進一步研究發現PPARα的表達、SOD2含量及SODs活性升高，結合PPARα作為核轉錄因子的功能，進一步說明非諾貝特可能是通過促進PPARα的表達以影響SOD2在體內的含量及其活性，以維持ROS在體內含量的相對穩定，從而在缺血∕再灌注損傷起保護作用。

為了進一步闡明非諾貝特調節SOD2的機制，本研究用體外實驗BMEC經非諾貝特處理和體內實驗C57BL∕6小鼠給予非諾貝特處理后分離腦組織中的微血管，其PPARα和SOD2的表達均升高，說明非諾貝特可以促進PPARα和SOD2的表達；進一步用SOD2基因啟動子序列構建的熒光素酶報告質粒轉染細胞后，經非諾貝特刺激，可以導致熒光素酶活性升高，說明非諾貝特調控SOD2的表達依賴于非諾貝特與SOD2基因間可能存在某種聯系；而當SOD2基因啟動子上PPRE結合序列的關鍵堿基發生突變后，即使給予非諾貝特刺激，pGL4 mu mSOD2的活性幾乎沒有改變，即由于SOD2基因啟動子上的PPRE與PPARα結合的堿基發生突變，導致PPARα無法與SOD2基因啟動子上的PPRE結合，從而非諾貝特激活SOD2基因啟動子活性的作用消失，說明非諾貝特調節SOD2的表達依賴于PPARα與SOD2基因啟動子區域上的PPRE結合，結合體內和體外實驗研究得到非諾貝特具有促進PPARα和SOD2的表達功能，說明非諾貝特對SOD2表達的調控作用依賴于激活的PPARα結合到SOD2基因啟動子的PPRE區域以促進SOD2基因啟動子的活性，從而促進SOD2的表達。

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