紫地榆中4種單體對3種致齲菌培養液中大分子物質吸光值的影響

李夢琪，羅胤珠，盧 燕，藍 海

（大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000）

齲病是危害人類口腔健康的一大疾病，是口腔的常見病。在我國人群患齲率為40%，其中兒童高達80%〔1-2〕。它不僅影響美觀，還給人們的日常生活造成極大的困擾，WHO將其列為重點防治的非傳染性的三大疾病之一。現代研究表明，人類齲病最重要的致病因子主要分為鏈球菌屬（Mutans streptococci）、乳桿菌屬（Lactobacillus Beijerinck）和放線菌屬（actinomyces）〔3-6〕。現選取鏈球菌屬中的變形鏈球菌、放線菌屬中的黏性放線菌、乳桿菌屬中的嗜酸乳桿菌進行實驗。

紫地榆（Geranium strictipes）是牦牛兒苗科老鸛草屬植物，藥用部位為根。前期實驗證明，紫地榆的乙酸乙酯、正丁醇等提取部位對致齲菌具有抑制作用〔7-9〕。從紫地榆中分離的物質包括沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素等12種成分〔10-11〕。現選取含量較高的沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素4種單體對3種致齲菌變形鏈球菌、黏性放線菌、嗜酸乳桿菌的培養液中大分子物質吸光值進行測定，為更進一步研究紫地榆對致齲菌的作用提供基礎。

1 材料和儀器

1.1 材料供試菌種為變形鏈球菌（Streptococcus mu?tans）ATCC 25175，黏性放線菌（Actinomyces viscosus）ATCC 277044，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ASI.1854，以上菌株均購于廣東省微生物菌種保藏中心。沒食子酸、沒食子酸甲酯標準品購于山東西亞化學股份有限公司，兒茶素標準品購于上海源葉生物科技有限公司，鞣花酸標準品購于上海麥克林生化科技有限公司，胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物（Trypticase-phytone-yeast extractm edium，TPY）固體及液體培養基、MRS固體及液體培養基均購于青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），隔水式恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司），TGL-16A高速離心機（常州邁科諾儀器有限公司），超凈臺（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司），2.5 L圓底立式厭氧培養袋（青島海博生物技術有限公司），紫外分光光度計（北京普析通用儀器公司）。

2 方法

2.1 菌液的制備在37℃、80%N2、20%CO2、厭氧條件下用TPY液體培養基（嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基）培養復蘇48 h后的菌種培養18 h。通過生化鑒定及涂片檢查為純培養后，分別挑取單個菌落于TPY液體培養基（嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基）在相同條件下培養18 h增菌，使用麥氏比濁管調整菌懸液濃度至0.5 McFarland（108CFU∕mL）備用〔12〕。

2.2 紫地榆中4種單體對3種致齲菌培養液中大分子物質吸光值的影響根據沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素對3種細菌的MIC（最小抑菌濃度）和MBC（最小殺菌濃度）的測定結果，選取MIC值以下的4個濃度梯度配制成TPY液體培養基（嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基）。按菌懸液與TPY液體培養基（嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基）比例為1：10（v/v）比例接種此菌后，置37 ℃、80%N2，20%CO2、厭氧條件下搖動培養。分別在0、2、4、6、8、10 h時取樣液5 mL，3 000 r∕min離心15 min，取上清液備用。用紫外分光光度計在260 nm處測定上清液中DNA、RNA等大分子物質的吸光度。陰性對照組為不含藥物的培養基中細菌的吸光度，陽性對照組為含0.05%洗必泰的培養基中的細菌吸光度〔13〕。每組有3個平行管，實驗重復3次。

3 結果和分析

本實驗測定的是紫地榆中4種單體對3種致齲菌作用后細菌的培養液中大分子物質的外漏量。因為大分子物質如DNA、RNA等在260 nm波長處有較強的吸收，所以用大分子物質在260 nm波長處的吸收值的變化推測細菌細胞膜的完整性。在0～8 h內，沒食子酸0.5～2.0 mg∕mL、沒食子酸甲酯1～2 mg∕mL、兒茶素0.125～0.500mg∕mL、鞣花酸0.25～0.50 mg∕mL對變形鏈球菌培養液電導率的作用效果優于陽性藥物。見圖1。

在0～10h內，沒食子酸0.5～2.0mg∕mL、沒食子酸甲酯0.125～1.000mg∕mL、兒茶素0.0625～0.2500mg∕mL、鞣花酸0.031 25～0.250 00 mg∕mL對黏性放線菌培養液電導率的作用效果優于陽性藥物。見圖2。

在0～8 h內，沒食子酸0.25～2.00 mg∕mL、沒食子酸甲酯0.25～1.00 mg∕mL、兒茶素0.25～1.00 mg∕mL、鞣花酸0.125～0.500 mg∕mL對嗜酸乳桿菌培養液電導率的作用效果優于陽性藥物。見圖3。

圖1 紫地榆中4種單體對變形鏈球菌培養液中大分子物質吸光值的影響

圖2 紫地榆中4種單體對黏性放線菌培養液中大分子物質吸光值的影響

圖3 紫地榆中4種單體對嗜酸乳桿菌培養液中大分子物質吸光值的影響

由圖1～3可以看出沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸4種單體對變形鏈球菌、黏性放線菌、嗜酸乳桿菌培養液中大分子物質的外漏有增強作用。并且隨時間和藥物濃度的增加，大分子物質的吸光值逐漸增大。由實驗可以看出與空白組相比，4種單體可明顯增加大分子物質在260 nm的吸光值，表明細菌細胞內DNA、RNA等大分子物質外漏，細菌細胞膜通透性增加，細胞膜的完整性遭到破壞。

4 討論

本實驗對紫地榆中的4種單體對3種致齲菌培養液中大分子物質吸光值進行了研究，結果顯示不同濃度的沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸均能增加變形鏈球菌、黏性放線菌、嗜酸乳桿菌培養液中大分子物質的吸光值，且隨時間和藥物濃度的增加而增大。

在0～2 h內吸光值變化較小，主要原因為細菌數量較少，培養液中大分子物質較少。在2～8 h內細菌成對數級增長，此時藥物對細菌作用明顯，破壞細菌細胞膜的完整性，使細菌內大分子物質外漏，培養液的吸光值增加。8 h以后，細菌生長緩慢，細菌內大分子外漏減少，培養液的吸光值增長變緩。實驗中隨濃度增加，培養液的吸光值越大，是因為藥物濃度越大，對細菌的細胞膜破壞越大，細菌內大分子外漏越多，培養液吸光值越大。與陽性對照組相比，大多數組的效果優于陽性對照組，說明紫地榆中4種單體對3種致齲菌的細胞膜有破壞作用。推測其原因可能是沒食子酸等4種單體誘導菌體產生了某些酶，降解了細胞膜，或者是藥物與菌體細胞膜結合，破壞了細胞膜的完整性，使細胞內物質外漏。

綜上所述，不同濃度的沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸能增加變形鏈球菌、黏性放線菌、嗜酸乳桿菌細胞膜的通透性，使細胞膜的完整性遭到破壞。為研究紫地榆在防齲方面的作用提供了理論依據，對齲病的進一步研究和開發新型防齲藥物提供幫助。

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