美洲大蠊醇提物對小鼠免疫調(diào)節(jié)功能影響及抗疲勞作用的研究

國 超，賴 泳

（大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000）

美洲大蠊（Periplaneta americana），俗稱“蟑螂”，屬蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬，當代藥理學及臨床研究顯示其具有較好的抗腫瘤、修復破損黏膜、保護心肌細胞、增強免疫力及抗炎作用〔1-6〕，美洲大蠊提取物在體外具有抗氧化能力，然而，其在體內(nèi)的抗氧化效果卻未見報道〔7〕。本實驗研究了美洲大蠊醇提物體內(nèi)的抗疲勞、抗缺氧作用，旨在為研究美洲大蠊的藥理作用機制提供資料，為美洲大蠊的食用和藥用價值的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物SPF級昆明種小鼠240只，雌雄各半，體重（20±2）g，昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。

1.2 主要試劑及實驗器材美洲大蠊提取物由大理大學何正春老師提供，美洲大蠊購自彌渡縣美洲大蠊養(yǎng)殖中心。取美洲大蠊藥材粉末，用乙醇、水依次加熱回流提取2次，每次2 h，濾過，回收溶劑，濃縮，得乙醇提取物（美洲大蠊提取物Ⅱ）、水提取物（美洲大蠊提取物Ⅰ），實驗前用生理鹽水將醇提物配成所需濃度。實驗所用測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。MTX-150低溫高速離心機（TOMY，日本）；電熱三用水箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠有限責任公司）；756 MC紫外可見分光光度計；電子天平（sartorius德國）；恒溫水浴槽；玻璃游泳箱（50 cm×50 cm×40 cm，自制）。

1.3 美洲大蠊醇提物對小鼠耐常壓缺氧試驗取l8～22 g小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只，其中3組分別灌服高劑量［80 mg∕（kg·d）］、中劑量［40 mg∕（kg·d）］、低劑量［20 mg∕（kg·d）］的美洲大蠊醇提物的生理鹽水溶液；空白對照組灌服同體積的生理鹽水；陽性對照組選用心得安（鹽酸普萘洛爾）作為陽性藥〔8〕。1 次∕d，持續(xù)14 d，末次給藥30 min后，將小鼠放入盛有10 g鈉石灰的125 mL廣口瓶中（瓶口涂有凡士林），加蓋密封，以無呼吸（小鼠胸部不起伏）為指標，記錄小鼠存活時長〔9〕。

1.4 美洲大蠊醇提物對小鼠的力竭游泳試驗取l8～22 g小鼠50只，雌雄各半，分組同“1.3”項。1 次∕d，持續(xù)14 d，末次給藥30 min后，將小鼠置入（30±1）℃、50 cm×50 cm×40 cm玻璃缸內(nèi)，記錄各小鼠自入水開始到力竭（小鼠頭部沉入水中10 s無法浮出水面）溺死的時長。

1.5 美洲大蠊醇提物對正常小鼠免疫器官指數(shù)的影響取l8～22g小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只，其中3組分別灌服高劑量［80 mg∕（kg·d）］、中劑量［40 mg∕（kg·d）］、低劑量［20 mg∕（kg·d）］的美洲大蠊醇提物的生理鹽水溶液；空白對照組灌服同體積的生理鹽水；陽性對照灌服同體積左旋咪唑［50 mg∕（kg·d）］的生理鹽水。1次∕d，持續(xù)14 d。胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的計算方法為不同分組小鼠試驗結(jié)束后小鼠稱重，然后剖取胸腺、脾臟，用天平稱濕重并計算臟器指數(shù)。

1.6 美洲大蠊醇提物對小鼠碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)（校正）α的影響取l8～22 g小鼠50只，雌雄各半，分組同“1.5”項。1次∕d，持續(xù)14 d。末次給藥后1 h，取印度墨汁，反復振動至搖勻，用1%明膠液稀釋4倍。于鼠尾靜脈注入稀釋的墨汁0.01 mL∕g。注入墨汁后30 s及6 min用取血吸管從小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血0.025 mL，立刻吹入0.1%碳酸鈉（Na2CO3）溶液2 mL中，并反復吸入、吹出，充分洗出吸管壁附著的血液，校零，于756分光光度計上675 nm處比色〔10〕，按下式計算吞噬指數(shù)K及吞噬系數(shù)α：K=（1gC1-lgC2）∕（T2-T1）；α=W*K1∕3∕WLS。公式中C為血中碳粒濃度，T為時間，W為體質(zhì)量，WLS為肝、脾質(zhì)量之和。

1.7 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（± s）表示，用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊醇提物對小鼠耐常壓缺氧實驗與空白對照組相比，通過連續(xù)14 d的不同劑量美洲大蠊醇提物的服用，各組小鼠耐常壓缺氧存活時間明顯延長，尤以中、高劑量組延長較為顯著（P＜0.05）。見表1。

表1 美洲大蠊醇提物對小鼠耐常壓缺氧存活時間的影響（±s，n=10）

表1 美洲大蠊醇提物對小鼠耐常壓缺氧存活時間的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比較*P＜0.05；與陽性對照組比較#P＜0.05。

組別 劑量∕（mg∕kg） 延長率∕%—13.40 0.50 16.70 33.03空白對照組普萘洛爾組美洲大蠊低劑量組美洲大蠊中劑量組美洲大蠊高劑量組— 7 2 0 40 80存活時間∕min 37.62±4.3 42.64±3.7*37.81±4.4 43.88±4.9*50.02±4.2*#

2.2 美洲大蠊醇提物對小鼠游泳能力的影響與空白對照組相比，通過連續(xù)l4 d的不同劑量美洲大蠊醇提物的服用，各組的游泳時間明顯延長，LDH活性升高，尤以中、高劑量組提高更為顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 美洲大蠊醇提物對小鼠游泳時間及耐力運動小鼠LDH活性的影響（±s，n=10）

表2 美洲大蠊醇提物對小鼠游泳時間及耐力運動小鼠LDH活性的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比較*P＜0.05；與陽性對照組比較#P＜0.05。

LDH∕（U∕10 mL）3.31±0.42 4.18±0.33 3.56±0.12 4.42±0.18*4.93±0.09*#組別空白對照組普萘洛爾組美洲大蠊低劑量組美洲大蠊中劑量組美洲大蠊高劑量組劑量∕（mg∕kg）— 7 2 0 40 80游泳時間∕min 298.35±105.26 357.89±92.15*306.64±98.59 399.36±88.57*#420.75±102.46*#

2.3 美洲大蠊醇提物對小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響美洲大蠊醇提物高、中、低劑量組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于空白對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 美洲大蠊對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10）

表3 美洲大蠊對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比較*P＜0.05，與空白對照組比較△P＜0.01；與陽性對照組比較#P＜0.05。

胸腺指數(shù)∕（mg∕10 g）12.43±1.13 22.61±.2.09*15.85±2.37 21.63±1.45*28.37±2.90*△#組別空白對照組左旋咪唑組美洲大蠊低劑量組美洲大蠊中劑量組美洲大蠊高劑量組劑量∕（mg∕kg）—50 20 40 80脾臟指數(shù)∕（mg∕10 g）25.72±3.46 35.75±7.65*30.34±7.52 33.32±9.68*42.47±9.77*#

2.4 美洲大蠊醇提物對小鼠碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)（校正）α的影響與空白對照組相比，通過連續(xù)l4 d的不同劑量美洲大蠊醇提物的服用，各組小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均增大，尤以中、高劑量組增大較為顯著（P＜0.05）。見表4。

表4 美洲大蠊對小鼠碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)（校正）α的影響（±s，n=10）

表4 美洲大蠊對小鼠碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)（校正）α的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比較*P＜0.05，與空白對照組比較△P＜0.01；與陽性對照組比較#P＜0.05。

吞噬指數(shù)（校正）α 4.823±0.859 17.637±3.059*5.538±1.453 9.893土1.933*24.743±2.564*△#組別空白對照組左旋咪唑組美洲大蠊低劑量組美洲大蠊中劑量組美洲大蠊高劑量組劑量∕（mg∕kg）—100 20 40 80碳粒廓清指數(shù)K 0.044±0.016 0.064±0.025*0.046±0.016 0.057±0.039*0.081±0.011*#

3 討論

美洲大蠊具有抗肝炎、抗腫瘤、抗菌、抗HIV病毒、提升機體免疫力、消炎鎮(zhèn)痛、促進血管增生、組織修復等作用〔10-14〕。疲勞是機體的一種復雜生理化學變化過程，它既標志著機體原有工作能力的暫時下降，又是機體發(fā)展到疾病狀態(tài)的一個征兆。若疲勞得不到及時緩解將會逐漸積累，最終導致過度疲勞，使機體發(fā)生內(nèi)分泌紊亂、免疫力下降，甚至出現(xiàn)器質(zhì)性病變。運動耐力的提高是抗疲勞能力增強的直接體現(xiàn)〔15〕。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊能夠顯著延長小鼠游泳時間產(chǎn)生抗疲勞作用。與空白對照組比較發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊給藥組能明顯延長小鼠游泳時間，中劑量組與高劑量組和空白組比較差異有統(tǒng)計學意義，與陽性對照組比較高劑量組延長游泳時間有顯著差異。說明美洲大蠊醇提物能提升小鼠抗疲勞能力。

缺氧對機體是一種厲性刺激，影響機體代謝，特別是影響機體的氧化供能，最終會導致機體的心腦等重要器官缺氧、缺少供能，最后死亡〔16〕。此外，小鼠斷頭后，因為供血終止，在短期內(nèi)腦中原有的血液和營養(yǎng)物質(zhì)尚能使腦功能維持短時間，小鼠顯示出有規(guī)律地張口喘氣，以喘氣時間為指標可觀察藥物對腦缺血的保護作用〔17〕。在常壓耐缺氧實驗中，與空白對照組比較，美洲大蠊中劑量組和高劑量組能顯著延長小鼠在常壓缺氧條件下的存活時間；與陽性對照組比較顯示，高劑量給藥組能顯著延長小鼠在常壓缺氧條件下的存活時間。凡能使腦耗氧減少的藥物均能延長小鼠喘氣時間。本實驗中美洲大蠊醇提物能延長小鼠斷頭張口喘息時長。

碳粒廓清指數(shù)表示在一定范圍內(nèi)，小鼠對進入機體碳粒的清除速率，是非特異性免疫功能的指標〔18〕。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)也作為評價小鼠免疫力的重要指標。本實驗對小鼠給藥后的臟器指數(shù)和碳粒清除率進行了檢測。實驗表明各治療組吞噬指數(shù)K及吞噬系數(shù)α均增高（P＜0.05），中劑量組和高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，高劑量組與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明均能增強造模小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，提示美洲大蠊能刺激免疫器官的細胞增生，使免疫器官指數(shù)升高，從而提高機體的免疫功能。不同劑量美洲大蠊給藥組小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)也高于空白對照組，中劑量組和高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，高劑量組與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。提示美洲大蠊醇提物可以通過提升細胞免疫功能、增加免疫器官的質(zhì)量等提高機體的免疫功能。

綜上所述，小鼠灌服美洲大蠊醇提物后提高了小鼠機體內(nèi)環(huán)境對氧代謝過程的調(diào)節(jié)機能，從而加強了小鼠的低氧游泳耐力，在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，顯著改善小鼠抗疲勞作用，同時也增強了機體的免疫能力，由此認為美洲大蠊具有廣闊的應用前景。

［參考文獻］

〔1〕吳道勛，邵維莉，常旭，等.美洲大蠊提取物對H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞的影響〔J〕.大理大學學報，2017，2（8）：1-5.

〔2〕陳俊雅，耿玲，吳道勛，等.美洲大蠊提取物聯(lián)合環(huán)磷酰胺對H22荷瘤小鼠的作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2015，21（23）：130-134.

〔3〕牛春麗，曾菁，夏盟愷，等.肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結(jié)腸炎的影響〔J〕.大理學院學報，2015，14（4）：12-16.

〔4〕陸麗，張旭強，甘平，等.美洲大蠊提取物對ISO致大鼠心肌缺血的保護作用〔J〕.大理學院學報，2014，13（8）：7-10.

〔5〕李嬌，張冰清，劉光明，等.美洲大蠊脫脂膏對小鼠免疫功能的影響〔J〕.大理大學學報，2015，14（10）：1-5.

〔6〕陳俊雅，李洪文，吳道勛，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3抗炎作用及機制研究〔J〕.大理學院學報，2015，14（2）：8-11.

〔7〕焦春香，張成桂，劉光明，等.美洲大蠊提取物中抗衰老活性部位抗氧化活性的初步分析〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（6）：1389-1391.

〔8〕于蕾妍，鄒本革，周穎，等.螺旋藻復合多糖與銀杏提取物對小鼠耐缺氧能力的影響〔J〕.動物醫(yī)學進展，2017，38（4）：72-74.

〔9〕張爽，蔡璐，潘雪，等.復方人參合劑對小鼠抗疲勞和耐缺氧能力的影響〔J〕.人參研究，2015，27（2）：8-10.

〔10〕李儀奎.中藥藥理實驗方法學〔M〕.2版.上海：上海科學技術(shù)出版社，2006：721-728.

〔11〕胡艷芬，呂小滿，劉光明，等.美洲大蠊提取物對3株人肺癌細胞的體外抑制作用〔J〕.大理學院學報，2009，8（12）：1-3.

〔12〕何正春，胡明輝，王曉雨，等.美洲大蠊提取物對3株人及小鼠白血病細胞的細胞毒性研究〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志，2009，30（5）：56-57.

〔13〕焦春香，劉光明，周萍.天然藥物康復新的研究進展〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（11）：2623-2624.

〔14〕戴云，曾茗，項朋志.蜚蠊的藥用價值〔J〕.中藥材，2005，28（9）：848-850.

〔15〕金曉玲，杜紅巖，李欽.杜仲雄花茶對小鼠抗疲勞作用的研究〔J〕.食品科學，2008，29（7）：432-434.

〔16〕唐玉琴，淮文英，王艷秋，等.表觀遺傳缺氧作用機制的新研究〔J〕.當代醫(yī)學，2017，23（15）：189-192.

〔17〕韋坤璇，鄧之婧，甘露，等.二氫楊梅素對小鼠急性腦缺血缺氧的保護作用〔J〕.廣西醫(yī)科大學學報，2017，34（3）：347-350.

〔18〕楊奕櫻，潘春，張秋方，等.雙白半水提浸膏對環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫功能的影響〔J〕.河南中醫(yī)，2017，37（7）：1190-1192.