大紅袍β-羥高鐵血紅素形成抑制活性研究

陳 浩，劉曉薇 ，沈 怡，崔淑君，肖朝江，姜 北 *

（1.大理大學藥物研究所，云南大理 671000；2.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000）

瘧疾（Malaria）是當今社會中對人體健康危害最為嚴重的主要寄生蟲病之一。根據世界衛生組織相關的報道，全球每年患病的人數高達1.49～3.03億，其中死亡人數近百萬。2015年全球95個瘧疾傳播的國家和地區共有2.14億臨床病例，其中88%的瘧疾病例和90%的死亡病例發生于非洲地區，少數發生于東南亞地區〔1〕。瘧原蟲作為瘧疾的病原體，目前已知有200余種，寄生于人體內的共有5種，即間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）、三日瘧原蟲（P.malariae）、惡性瘧原蟲（P.falciparum）、卵形瘧原蟲（P.ovale）、諾氏瘧原蟲（P.knowlesi），分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧、卵形瘧和諾氏瘧。在我國主要以間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲為主〔2〕。但隨著近幾年我國前往非洲務工人員的增加，其余3種感染病例也在逐年上升〔3〕。與此同時，由于抗瘧藥的不斷使用，瘧原蟲已對其產生了抗藥性，甚至出現了多重耐藥性〔4-5〕。因此，研發新一代的抗瘧藥物刻不容緩。云南植物資源豐富，利用該地區植物資源多樣性進行新型抗瘧先導成分研究具有極大的可行性。為此本課題組前期采用β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗〔6-9〕，對采自云南西部地區64種植物的128個供試樣品進行了抗瘧活性篩選，結果發現大紅袍粗提物具有較好的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性。大紅袍系豆科（Leguminosae）杭子梢屬（Campy?lotropis）植物毛杭子梢［Campylotropis hirtellae（Franch.）Schindl.］的干燥根，主要分布于我國四川、貴州、西藏、云南等地〔10〕，具有止痛活血、調經、收斂的功效〔11〕。為追蹤其抗瘧活性成分，本實驗采用柱色譜和波譜學技術對活性部位進行成分分離和結構鑒定，結果從活性較好的乙酸乙酯部位分離鑒定了3個主要成分，分別是兒茶素（1）、胡蘿卜苷（2）、大豆腦苷I（3）。見圖1。

圖1 化合物1～3的結構

1 材料與儀器

1.1 實驗材料本實驗所用大紅袍（Radix Campy?lotropidis Hirtellae）植物樣品于2016年7月采自云南省大理市洱源縣煉鐵鄉，經大理大學藥學與化學學院生藥學教研室張德全博士鑒定，植物標本現保存于大理大學藥物研究所姜北教授課題組，標本編號為20160710-3b。

1.2 儀器與試劑BioTek Synergy HT多功能酶標儀（BioTek Instruments Inc.）；RE-5205旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；Bruker Avance III-400核磁共振波譜儀（TMS為內標）；CoolSafe 95-15冷凍干燥機（丹麥LaboGene公司）；MCO-18AIC CO2培養箱（日本三洋公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）、氯喹二磷酸鹽、氯高鐵血紅素（美國Sigma公司）；乙酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；冰醋酸、吡啶（上海申博化工有限公司）；氫氧化鈉（重慶川東化工集團有限公司）；二甲基亞砜（天津化學試劑有限公司）；鹽酸（西隴化工股份有限公司），甲醇、丙酮、氯仿等試劑均為工業級有機溶劑均重蒸后使用；其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 提取分離大紅袍（24.1 kg）粉碎后以95%乙醇共冷浸提取6次，減壓濃縮所得總浸膏用適量水充分混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行分配，即得相應萃取物。其乙酸乙酯萃取物浸膏（470.0 g）用適量粗硅膠（80～100目）混合拌樣后經200～300目硅膠柱層析，采用氯仿-甲醇混合溶劑進行梯度洗脫（1：0至0：1），經TLC檢測后合并相同的流分共得19個組分（A～S）。其中，組分O經硅膠柱層析（氯仿-丙酮）得到化合物1（4.30 g）。組分M經大孔樹脂（甲醇-水）和Sephadex LH-20（氯仿：甲醇=1：1）柱色譜得到化合物2（1.02g）和化合物3（1.41g）。2.2 β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測試方法 β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測試方法參照文獻〔6-9〕，并將其進行適當改良后按照如下操作進行，即將50 μL不同濃度的供試樣品和50 μL氯高鐵血紅素儲備液（1.0 mmol∕L）分別加于96孔板中，平行設置3個復孔；同時設置蒸餾水溶媒對照組和氯喹陽性對照組。然后每孔加入80 μL醋酸鹽緩沖液（pH 5.0，4 mol∕L），置于50 ℃培養箱中孵育5 h，取出96孔板，待其恢復至室溫后向每孔加入100 μL 30%（v/v）的吡啶-HEPES（pH 7.5，20 mmol∕L）溶液使96孔板中的固體充分混懸，室溫放置待未反應的羥高鐵血紅素溶解完全后；于每孔中移取50 μL上清液至另一96孔板中，之后向每孔中加入200 μL吡啶-HEPES溶液進行稀釋，并將其置于405 nm波長處測定吸收值。由羥高鐵血紅素標準曲線得出未反應的羥高鐵血紅素的濃度，計算出供試品對β-羥高鐵血紅素形成的抑制濃度（以IC50表示）。

3 實驗結果

3.1 受試樣品的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測定結果參照“2.2”的實驗方法對大紅袍粗提物以及其各溶劑相應萃取物進行了β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測定。見表1。從表1中可以看出，大紅袍的粗提物及各溶劑相應萃取部位都具有較好的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，其中活性最佳脂溶性部位為乙酸乙酯部位，IC50值為（232.7±12.4）μg∕mL。因此，該研究利用硅膠和大孔樹脂等柱層析技術方法對活性最好的乙酸乙酯部位進行活性追蹤。結果從中分離得到3個化合物，其中化合物1具有一定的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性。見表2。

3.2 結構鑒定化合物1：淡黃色粉末。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.83（1H，d，J=1.9Hz，H-2′），6.76（1H，d，J=8.1Hz，H-5′），6.71（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），5.92（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），5.84（1H，d，J=2.3 Hz，H-6），4.55（1H，d，J=7.5 Hz，H-2），3.97（1H，dt，J=7.9，5.4 Hz，H-3），2.84（1H，dd，J=16.1，5.4 Hz，H-4a），2.50（1H，dd，J=16.1，8.2 Hz，H-4b）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：82.9（C-2），68.8（C-3），28.6（C-4），157.8（C-5），96.2（C-6），157.6（C-7），95.4（C-8），156.9（C-9），100.8（C-10），132.2（C-1′），115.2（C-2′），146.3（C-3′），146.2（C-4′），116.0（C-5′），120.0（C-6′）。上述波譜數據與文獻〔12〕報道的基本一致，故鑒定化合物1為兒茶素。

表1 大紅袍粗提物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測定結果（±s，n=3）

表1 大紅袍粗提物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測定結果（±s，n=3）

不同濃度（μg∕mL）植物提取物的β-羥高鐵血紅素形成抑制率∕%樣品名IC50∕(μg∕mL)氯喹二磷酸鹽粗提物石油醚萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物萃余水相1 388.9 81.7±3.6 51.6±9.8-8.5±1.3 10.7±3.3 49.1±4.4 84.0±1.2 277.8 82.2±3.1 65.6±2.3 54.4±2.3 57.8±5.1 51.4±0.9 68.0±1.6 55.6 82.4±5.3 8.3±0.3 0.5±3.5 21.8±11.5-4.9±2.8-1.2±2.8 11.1 1.0±3.2 2.5±1.7 0.2±0.4-1.6±3.0-0.5±1.8-1.1±0.5 2.2-1.1±1.5 5.3±3.7-1.8±2.1 1.9±2.4-0.9±6.4 1.3±1.4 36.6±1.8 214.4±8.7 262.0±9.6 232.7±12.4 279.6±3.2 215.2±3.3

表2 大紅袍中單體化合物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測定結果（±s，n=3）

表2 大紅袍中單體化合物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測定結果（±s，n=3）

不同濃度（μg∕mL）化合物的β-羥高鐵血紅素形成抑制率∕%化合物IC50∕(μg∕mL)1 2 3 277.8 14.2±2.1 0.1±0.1-5.2±1.9 55.6 12.6±1.5 1.5±0.8-8.6±0.3 11.1 4.1±1.5 0.5±1.0-5.5±1.5 2.2 6.8±2.0 0.6±0.9-6.2±1.0 0.4 5.1±1.4 0.6±0.5-2.7±0.5＞277.8無活性無活性

化合物2：白色無定型粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.36（1H，brs，H-6），5.09（1H，d，J=7.7Hz，H-1′），4.60（1H，dd，J=11.8，2.4 Hz，H-6′a），4.45（1H，dd，J=11.8，5.2 Hz，H-6′b），4.35（1H，overlap，H-4′），4.33（1H，overlap，H-5′），4.10（1H，m，H-3），4.02（1H，overlap，H-2′），3.96（1H，overlap，H-3′），0.99（3H，d，J=6.4Hz，Me-21），0.93（3H，s，Me-19），0.92～0.85（12H，overlap，4×Me），0.65（3H，s，Me-18）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：37.6（C-1），30.4（C-2），78.8（C-3），39.5（C-4），141.0（C-5），122.1（C-6），32.3（C-7），32.2（C-8），50.5（C-9），37.1（C-10），21.4（C-11），40.1（C-12），42.6（C-13），56.3（C-14），24.7（C-15），28.7（C-16），56.9（C-17），12.1（C-18），19.3（C-19），36.5（C-20），19.2（C-21），34.3（C-22），26.5（C-23），46.1（C-24），29.6（C-25），19.6（C-26），20.1（C-27），23.5（C-28），12.3（C-29），102.7（C-1′），75.5（C-2′），78.7（C-3′），71.8（C-4′），78.2（C-5′），62.9（C-6′）。上述波譜數據與文獻〔13〕報道的基本一致，故鑒定化合物2為胡蘿卜苷。

化合物3：白色無定型粉末。ESI-MS m/z：712［M–H］–。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：5.73（1H，dt，J=15.3，6.1 Hz，H-5），5.48（1H，dd，J=15.3，7.4 Hz，H-8），5.37（2H，t，J=4.7，H-4，9），4.26（1H，d，J=7.7Hz，H-1′′），4.14（1H，overlap，H-3），4.12（1H，overlap，H-1a），4.00（1H，overlap，H-2′），3.99（1H，overlap，H-2），3.86（1H，d，J=11.8 Hz，H-6′′a），3.70（1H，dd，J=10.3，3.3 Hz，H-1b），3.66（1H，dd，J=11.8，3.7 Hz，H-6′′b），3.34（1H，s，H-3′′），3.28（1H，overlap，H-4′′），3.27（1H，overlap，H-5′′），3.19（1H，t，J=8.4 Hz，H-2′′），2.19～2.01（6H，overlap，H2-6，7，10），1.70（1H，m，H-3′a），1.55（1H，m，H-3′b），1.44～1.28（38H，overlap，H2-11～17，4′～15′），0.90（6H，t，J=6.6Hz，Me-18，16′）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：70.0（C-1），54.9（C-2），73.0（C-3），130.2（C-4），134.6（C-5），33.9（C-6），28.1（C-7），131.5（C-8），131.6（C-9），28.5（C-10），30.8（C-11），30.7～33.3（C-12～16），24.0（C-17），14.7（C-18），177.5（C-1′），73.2（C-2′），36.1（C-3′），26.5（C-4′），30.7～33.3（C-5′～14′），24.0（C-15′），14.7（C-16′），104.9（C-1′′），75.2（C-2′′），78.1（C-3′′），71.7（C-4′′），78.2（C-5′′），62.8（C-6′′）。上述波譜數據與文獻〔14〕報道的基本一致，故鑒定化合物3為大豆腦苷I。

4 討論

β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗作為一種體外抗瘧活性間接測定的研究方法，具有操作簡單、快捷、樣品用量少等高通量篩選實驗所具備的特性〔6-9，15-16〕。然而，本實驗利用硅膠和大孔樹脂等柱層析技術方法對活性部位追蹤分離得到的3個主要成分，僅化合物1顯示出微弱的活性，分析其原因可能有兩個：一方面可能是大紅袍的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性源自未分離到的某些微量成分或是源自多成分協同作用的結果；另一方面，也有可能是色素干擾實驗所致，由于大紅袍提取物、萃取部位具有較深的顏色，其對本研究于405 nm波長處測定吸收值可能產生干擾，造成假陽性結果。因此，該植物的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性成因與物質基礎仍有待進一步研究。

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