UPLC法測定血栓通注射液中人參皂苷類成分的含量

1.紅河州食品藥品檢驗所，云南　蒙自　661100；2.昆明市食品藥品檢驗所，云南　昆明　650032

UPLC法，是在HPLC法上進(jìn)一步開發(fā)得來的，較之傳統(tǒng)的HPLC法，UPLC法的主要突破表現(xiàn)在色譜分離上，色譜的解析度更高。高速度、高分離度和高靈敏度，是UPLC法的突出優(yōu)勢[1]。UPLC法目前還處于新興階段，實踐應(yīng)用主要集中于生化領(lǐng)域，而在天然產(chǎn)物的成分和精度分析上的應(yīng)用，也在逐漸興起。而對中成藥進(jìn)行成分分析，是確定藥品安全性，指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥的重要環(huán)節(jié)，所以，應(yīng)用UPLC法進(jìn)行中成藥中有關(guān)成分含量的測定，應(yīng)用也逐漸廣泛[2]。本研究分析兩種方法在中成藥的人參皂苷類成分含量測定中的應(yīng)用效果。

1　資料與方法

1.1一般資料

1.1.1樣品血栓通注射液(廣西梧州制藥(集團)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z45021769)為分析樣品，樣品來自本藥檢所留樣，為同一批次藥物；對照品來自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2儀器島津LC-20AT型號的高效液相色譜儀(SHIMADZU)；ACQuty Arc(2998PDA)型號的超高效液相色譜儀(Waters)；DV215CD型十萬分之一電子天平(OHAUS)；BS110S型萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2方法

1.2.1樣品溶液制備 準(zhǔn)確稱取樣品(0.50±001)g，加入50 mL濃度為70%的甲醇溶液，嚴(yán)密稱重后，超聲提取30 min(頻率設(shè)置為33 kHz，功率設(shè)定為250 W)，再次嚴(yán)密稱重，用等濃度甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻、濾過，經(jīng)0.22 μm的有機濾膜濾過后，取續(xù)濾液即得，進(jìn)行液相分析。

1.2.2對照品溶液制備用70%的甲醇溶液，將人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd以及三七皂苷R1對照品配制成各含1 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，在4 ℃條件下保存待用，進(jìn)行液相分析。

1.2.3參數(shù)和色譜條件兩種檢測方法的流動相條件相同，柱溫、檢測波長以及進(jìn)樣量相同，操作差異主要表現(xiàn)在流速和梯度洗脫程序上，具體為：①UPLC法：以乙腈(A)與濃度為0.05%的磷酸(B)為流動相，進(jìn)行梯度洗脫；將柱溫控制在30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長設(shè)定為203 nm，每次進(jìn)樣的樣品體積為2 μL ；②HPLC法：流動相條件與UPLC法相同。進(jìn)行梯度洗脫。將柱溫控制在30 ℃，流速為0.4 mL/min，檢測波長設(shè)定為203 nm，每次進(jìn)樣的樣品體積為2 μL。兩種方法下的梯度洗脫程序見表1。兩種方法下，均重復(fù)測量3次，取平均值。

表1　兩種方法的梯度洗脫程序

1.3觀察指標(biāo)觀察并對比兩種方法下，血栓通注射液樣品中人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd以及三七皂苷R1等五種皂苷類成分的平均含量測定值，比較兩種測定方法所需時間。

2　結(jié)果

2.1兩種檢測方法下人參總皂苷類成分含量測定結(jié)果本組研究針對同一批血栓通注射液樣本進(jìn)行人參皂苷類成分含量的測定，結(jié)果顯示，在UPLC法和HPLC法檢測下，受檢樣品的人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd以及三七皂苷R1這5種人參皂苷成分的含量和RSD值的測定結(jié)果無偏差，全部一致。詳見表2。

表2　人參皂苷類成分含量測定結(jié)果

2.2兩種檢測方法所用時間比較結(jié)果兩種檢測方法在一起流速參數(shù)設(shè)置以及色譜條件上有所差異，UPLC法檢測下，其梯度洗脫程序得到優(yōu)化，因此，檢測的色譜分離度更高，其檢測的速率也得以顯著提升，UPLC法下，平均用時(15.12±0.75)min，顯著短于HPLC法下的(47.15±0.73)min，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

3.1UPLC法的優(yōu)勢HPLC法是最早出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代末的分離分析技術(shù)，在多年間，不斷發(fā)展，受益于科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，色譜得到不斷完善，其分離速率、分離效率以及檢驗的靈敏度均逐年提升，已廣泛被應(yīng)用于多個學(xué)科領(lǐng)域。而在突破了色譜這一瓶頸限制后，在此基礎(chǔ)上開發(fā)成功的UPLC法呈現(xiàn)出更多優(yōu)勢，尤其在檢測速率上，得到顯著提升，且能夠保證檢測結(jié)果的精確，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的藥品分析和質(zhì)量測定中的應(yīng)用，尤其受到重視，其中比較重要的應(yīng)用方向即對藥物成分的含量測定[3]。

3.2UPLC法進(jìn)行成分測定的現(xiàn)實意義應(yīng)用UPLC法對合成類藥物及相關(guān)制劑進(jìn)行成分含量的測定，能夠不受藥物本身帶有的雜質(zhì)、相關(guān)添加劑或者共存藥物的影響，測定結(jié)果更為精確，能夠為臨床用藥提供更為準(zhǔn)確的指導(dǎo)，保證用藥劑量的科學(xué)性，提升用藥安全。吳立蓉等[4]曾經(jīng)應(yīng)用UPLC法對復(fù)方丹參片中皂苷類的含量進(jìn)行測定，并與HPLC法測定結(jié)果進(jìn)行對比，證實UPLC法測定的速率更快。

3.3HPLC法與UPLC法測定價值對比本研究中，以常用中成藥血栓通注射液為研究樣品，就傳統(tǒng)的HPLC法與UPLC法在對其中的人參皂苷進(jìn)行成分含量測定中的應(yīng)用價值進(jìn)行對比分析。研究中，樣品的選擇，色譜條件的建立均嚴(yán)格按照《中國藥典》中的相關(guān)規(guī)定設(shè)定，檢測波長以及流動相選擇，均為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格，最大限度杜絕了其他成分對測定結(jié)果的影響；此次研究中，為最大限度縮小誤差，使用了精密度為萬分之一和十萬分之一的超高精度電子天平對樣品進(jìn)行稱取，且測定結(jié)果取3次測定的平均值，相比于以往學(xué)者[5]的研究，測定數(shù)據(jù)具有更高的可信度。

測定結(jié)果顯示兩種方法下，研究所選批次的藥物的人參皂苷成分含量測定值以及RSD值均一致，提示兩種方法在中成藥人參皂苷成分含量的測定中，均具有良好的測定效果，具有很高的實踐應(yīng)用價值，可以作為藥品分析的首選手段。研究中，UPLC法與HPLC法相比，在分離速率、分離效率以及檢測的靈敏度上，同樣十分突出。而兩種方法主要的區(qū)別在于，UPLC法的更具高效性和快速性，可使測定時間顯著縮短[6]。本研究中，與HPLC法相比，UPLC法的測定耗時更短，二者相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，運用UPLC法對中成藥的人參皂苷成分含量進(jìn)行測定，準(zhǔn)確、高效，是更為科學(xué)的測定方法，在實踐應(yīng)用中，應(yīng)用效果更突出，值得推廣。

[1]安軍永,王世華,李云鵬,等.參芪益氣固本片中皂苷類成分的UPLC-MS測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2015,21(2):99-102.

[2]蔡艷,宋劍,王貴金,等.UPLC法測定人參總皂苷提取物中7種人參皂苷的含量[J].西北藥學(xué)雜志,2016,31(5):441-444.

[3]袁媛,徐榮培.超高液相色譜法分析人參新炮制品-黑參制作過程中人參皂苷成分變化[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2016,37(1):62-63.

[4]吳立蓉,王秀鳳,高衛(wèi)東,等.超高效液相色譜法快速測定復(fù)方丹參片中皂苷類成分的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2016,32(1):32-35.

[5]張曉旭,馬雪濤,胡蒙,等.超高效液相色譜法檢測6種人參皂苷含量[J].中國食品學(xué)報,2015,15(5):241-246.

[6]趙琳琳,趙云平,魏靜娜,等.UPLC法測定整參須根和蘆頭中人參皂苷的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(28):138-140.