基于納米金-羅丹明B體系檢測(cè)甲巰咪唑的研究

黨珍珍，紀(jì)得勇，田 銳,2*，馬紅燕,2*

(1.延安大學(xué) 化工學(xué)院，陜西 延安 716000；2.延安市分析技術(shù)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

甲巰咪唑(Thiamazole，2-mercapto-1-methylimidazole，MMI)，為咪唑類抗甲狀腺藥物，是臨床上用于各種類型的甲狀腺功能亢進(jìn)癥的一線治療藥物，長(zhǎng)期服用或者劑量過大均會(huì)使人體血液系統(tǒng)、骨及關(guān)節(jié)和消化系統(tǒng)產(chǎn)生不良反應(yīng)[1]。因此，建立準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定甲巰咪唑含量的方法對(duì)指導(dǎo)臨床用藥有著重要意義。目前測(cè)定甲巰咪唑的方法有化學(xué)發(fā)光分析法[2]、紫外分光光度法[3]、高效液相色譜法[4-5]、光度法[6-8]、電化學(xué)法[9-10]等。這些方法或使用儀器昂貴，或穩(wěn)定性、重現(xiàn)性不好，或操作不便，所以建立一種簡(jiǎn)便，快速，靈敏測(cè)定甲巰咪唑的方法尤為重要。

羅丹明B(RhB)是一種常用的熒光染料，可以通過靜電作用吸附到帶負(fù)電的金納米粒子(AuNPs)表面，AuNPs能夠通過與RhB間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移以及分子間碰撞使其熒光猝滅[11]，而不同粒徑、不同尺寸的金納米粒子對(duì)羅丹明B的熒光猝滅程度不同[12]。據(jù)此，本文通過向AuNPs、RhB體系中加入甲巰咪唑分子使體系中AuNPs聚集產(chǎn)生熒光信號(hào)變化，建立了一種測(cè)定甲巰咪唑的熒光分析新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-2700型熒光分光光度計(jì)、JEM-2100型透射電鏡(日本日立公司)；TU1901紫外-可見分光光度計(jì)(普析光學(xué)儀器有限公司)。

氯金酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸三鈉(分析純，西安化學(xué)試劑廠)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。甲巰咪唑藥片(10 mg/tablet，Merck KGaA)。

甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.876×10-2mol/L)：準(zhǔn)確稱取甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.5%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100030-200504)100 mg，用超純水溶解后定容于100 mL容量瓶中，使用時(shí)逐級(jí)稀釋。

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取47.9 mg羅丹明B(分析純，西安化學(xué)試劑廠)，用超純水溶解后，定容于100 mL容量瓶中。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

由檸檬酸鈉還原氯金酸得到的AuNPs被檸檬酸根保護(hù)，表面帶負(fù)電荷，通過靜電排斥作用使其保持穩(wěn)定。將AuNPs與RhB混合后，RhB分子可通過靜電作用吸附在AuNPs表面，此時(shí)，由于AuNPs對(duì)RhB分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)[13]；當(dāng)AuNPs發(fā)生團(tuán)聚時(shí)，其對(duì)RhB的熒光猝滅程度減弱[12]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲巰咪唑可使分散態(tài)AuNPs發(fā)生團(tuán)聚形成聚集態(tài)AuNPs，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色(圖1)，從而使其對(duì)RhB的熒光猝滅作用減弱，體系熒光信號(hào)增強(qiáng)，且增強(qiáng)程度在一定范圍內(nèi)與甲巰咪唑分子濃度成正比。

圖1 甲巰咪唑的熒光測(cè)定機(jī)理Fig.1 Schematic digram of the mechanism for thiamazole detection insert：the image of system with and without MMI;A:AuNPs+RhB,B:AuNPs+RhB+MMI

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1AuNPs的制備AuNPs按文獻(xiàn)方法[14]制備：將50 mL 1 mmol/L氯金酸加入100 mL圓底燒瓶中攪拌、加熱，待溶液開始回流后快速向其中加入5 mL 38.8 mmol/L檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)回流15 min后停止加熱，待溶液冷卻后用0.45 μm濾膜過濾，濾液置于棕色試劑瓶中，于4 ℃冰箱保存。

1.3.2實(shí)驗(yàn)方法取1.0 mL 1.0×10-5mol/L RhB溶液于10 mL比色管中，加入1.0 mL AuNPs溶液，搖勻，靜態(tài)作用1 h后，得到AuNPs-RhB測(cè)定液。分別取2.0 mL測(cè)定液于比色管中，然后分別向其中加入超純水和甲巰咪唑溶液定容，放置反應(yīng)50 min后，在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定對(duì)照組(FB)和樣品組(FS)的熒光信號(hào)值，根據(jù)兩者的熒光信號(hào)差值ΔF(ΔF=FS-FB)與甲巰咪唑濃度的關(guān)系來定量測(cè)定甲巰咪唑含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs的表征及實(shí)驗(yàn)機(jī)理驗(yàn)證

為確定所制備AuNPs的尺寸和形貌，對(duì)其進(jìn)行透射電鏡(TEM)和吸收光譜表征，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示合成的AuNPs在520 nm左右有強(qiáng)吸收，表明該AuNPs的直徑約13 nm且無(wú)團(tuán)聚[15]，由TEM結(jié)果(內(nèi)插圖)可見AuNPs粒徑的均一分散性良好。

圖2 AuNPs的吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectrum of AuNPs insert:TEM photograph of AuNPs

圖3 吸收光譜(A)及熒光光譜(B)Fig.3 Absorption(A) and fluorescence spectra(B)A：a.AuNPs;b.AuNPs-RhB;c.RhB;d.AuNPs-RhB-MMI;e.MMI;B：a.AuNPs-RhB-MMI;b.AuNPs-RhB

實(shí)驗(yàn)分別對(duì)AuNPs、AuNPs-RhB、AuNPs-RhB-甲巰咪唑、RhB進(jìn)行了光譜掃描，結(jié)果如圖3所示。由圖3A可見，向AuNPs中加入RhB后吸收光譜的形狀未發(fā)生變化，加入甲巰咪唑分子后，AuNPs在520 nm左右的吸收峰逐漸消失，而在720 nm處出現(xiàn)1個(gè)新峰，這是由于甲巰咪唑的加入引起了AuNPs的團(tuán)聚。圖3B為加入甲巰咪唑前后AuNPs-RhB體系的熒光光譜，圖中曲線a、b的峰形及最大發(fā)射波長(zhǎng)一致，表明AuNPs、甲巰咪唑未與RhB作用生成新物質(zhì)。但比較曲線a、b可發(fā)現(xiàn)，加入甲巰咪唑后體系的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，這是由于加入甲巰咪唑后,AuNPs發(fā)生團(tuán)聚，而聚集態(tài)AuNPs對(duì)RhB熒光的猝滅作用較分散態(tài)AuNPs小[12]，所以體系熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此體系熒光信號(hào)的變化是由于不同聚集態(tài)AuNPs對(duì)RhB熒光的猝滅作用所致。

2.2 分析條件的選擇

2.2.1溶液pH值溶液pH值是影響分析檢測(cè)的重要因素，實(shí)驗(yàn)考察了不同pH值(pH 4.0～8.0)對(duì)測(cè)定的影響，結(jié)果顯示，不同pH值體系中加入甲巰咪唑后其熒光增加值ΔF不同，當(dāng)體系pH值為7.0時(shí)ΔF最大。這可能是由于：pH值過低時(shí)，一方面RhB質(zhì)子化程度高使其與AuNPs的吸附作用增強(qiáng)，不利于RhB從AuNPs表面脫落；另一方面，甲巰咪唑分子中的巰基也可能質(zhì)子化使其與AuNPs的作用減弱，不能更有效地使AuNPs發(fā)生聚集。而當(dāng)pH值過高時(shí)，溶液中所含的OH-濃度逐漸增大，使得納米金表面吸附了一定量的OH-從而減少了納米金對(duì)RhB分子的吸附[13]，體系背景值增大，所以加入甲巰咪唑后，熒光增強(qiáng)較小。故選擇pH 7.0為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

2.2.2反應(yīng)時(shí)間在優(yōu)化條件下，按“1.3.2”方法配制溶液，每隔10 min測(cè)定其熒光。結(jié)果表明，40 min內(nèi)ΔF隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷降低，在50～70 min內(nèi)ΔF基本不變，此后，又隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。綜合考慮選擇反應(yīng)時(shí)間為50 min。

2.2.3AuNPs與RhB的濃度AuNPs和RhB的濃度直接影響測(cè)定的靈敏度，由于游離RhB自身有很強(qiáng)的熒光，如果其濃度太高，會(huì)使背景信號(hào)增大；反之，若RhB濃度太低，加入甲巰咪唑后形成的聚集態(tài)AuNPs使熒光增強(qiáng)減小，導(dǎo)致測(cè)定靈敏度降低。因此，實(shí)驗(yàn)考察了AuNPs和RhB的濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。選取1.0 mL 1.0×10-5mol/L RhB與不同體積AuNPs混合，靜態(tài)吸附1 h，加入2.0 mL甲巰咪唑，定容至10 mL，放置50 min后測(cè)定ΔF。結(jié)果表明，隨著AuNPs用量的不斷增加，ΔF急劇增加，當(dāng)AuNPs用量為1.0 mL時(shí)ΔF最大，隨后緩慢減小。所以本實(shí)驗(yàn)選擇AuNPs與1.0×10-5mol/L RhB等體積混合，稀釋10倍后測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，采用本方法對(duì)甲巰咪唑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在4.38×10-8～0.876×10-5mol/L濃度范圍內(nèi)體系的ΔF值與甲巰咪唑濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔF=4.54×107c+9.72，相關(guān)系數(shù)r=0.999，檢出限(S/N=3)為3.30×10-8mol/L。優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)0.876×10-6mol/L甲巰咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定11次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%。

2.4 干擾試驗(yàn)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了可能存在的添加劑對(duì)甲巰咪唑測(cè)定的影響。當(dāng)甲巰咪唑的濃度為0.876×10-6mol/L，1 400倍的Zn2+、Al3+、Mn2+、 Mg2+、 Ca2+、D-果糖，1 100倍的Cu2+、 Co2+，570倍的Fe3+、 Cr6+、Ba2+、蔗糖以及110倍的葡萄糖不干擾測(cè)定。

2.5 樣品測(cè)定

表1 藥品中甲巰咪唑含量測(cè)定結(jié)果(n=5)Table 1 Determination results of thiamazole in tablets(n=5)

隨機(jī)抽取10片甲巰咪唑藥片，研細(xì)混勻后準(zhǔn)確稱取適量(相當(dāng)于甲巰咪唑100 mg)，加入超純水溶解后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容、靜置，依次用濾紙和0.45 μm濾膜過濾，按本方法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，該法測(cè)得的甲巰咪唑含量與藥品的標(biāo)示量基本一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)得樣品回收率為96.2%～101.8%，表明該法用于甲巰咪唑片劑中甲巰咪唑含量的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

3 結(jié) 論

在RhB與AuNPs的混合體系中，AuNPs可通過共振能量轉(zhuǎn)移作用使RhB熒光猝滅，體系呈弱熒光，加入甲巰咪唑后，AuNPs發(fā)生團(tuán)聚，其對(duì)RhB的熒光猝滅作用減弱，體系熒光增強(qiáng)，據(jù)此建立了基于不同聚集態(tài)AuNPs與RhB間熒光共振能量轉(zhuǎn)移測(cè)定甲巰咪唑的熒光分析新方法。該方法線性范圍為4.38×10-8～0.876×10-5mol/L，檢出限為3.30×10-8mol/L，對(duì)藥物中甲巰咪唑的測(cè)定結(jié)果令人滿意。

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