分子印跡熒光傳感器的研制及其對呋喃妥因的特異性識別

丘秀珍，李勇瑩，彭翠紅

(韶關學院 化學與環境工程學院，廣東 韶關 512005)

呋喃妥因(Nitrofurantoin,NFT) 、呋喃唑酮(Furazolidone,FZD)和呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ ) 屬于硝基呋喃類( NFA) 廣譜抗生素，因價格較低且效果好而廣泛用于畜禽及水產養殖業，主要用于治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引起的腸炎、赤鰭病、潰瘍病等[1]。硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有致癌、致畸胎等副作用，1995年起歐盟禁止硝基呋喃類藥物在畜禽及水產動物食品中使用，并嚴格執行對水產中硝基呋喃的殘留檢測。硝基呋喃類抗生素對光敏感、在動物體內代謝速度快，難以在動物源性食品內檢出原藥殘留。因此，監測飼料和水樣中的硝基呋喃類抗生素可從源頭上監控 NFA 的非法使用[2]。目前，呋喃妥因的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[1,3-4]、電化學分析法[5]和酶聯免疫分析法[6]等。然而，這些技術存在樣品前處理復雜、成本高、選擇性低和耗時長等缺點。因此，亟需開發一種準確可靠、選擇性高、成本低的呋喃妥因的檢測技術，以滿足復雜樣品基質檢測的需求。

近年來，熒光碳量子點(Carbon quantum dots，CDs)作為碳材料家族的新成員，以其豐富而新穎的性質成為備受矚目的研究熱點，是發展最為迅速的一種熒光納米材料。碳量子點的尺寸一般小于10 nm，具有尺寸和激發波長可調的熒光性質[7]。相比于熒光半導體量子點，碳量子點具有毒性低、生物相容性好、化學穩定性高等優點，從而逐步代替傳統重金屬量子點在生物領域如生物細胞標記[8-9]、生物檢測[10-13]、藥物釋放[14]等方面的應用。分子印跡技術(Molecular imprinting technology，MIT)是將待分離的目標分子與功能單體通過共價或非共價作用進行預組裝，與交聯劑共聚制備得到聚合物。除去目標分子后，聚合物中形成與目標分子空間互補并具有預定的多重作用位點的“空穴”，對目標分子的空間結構具有“記憶”效應，能夠高選擇性識別復雜樣品中的印跡分子( MIP)[15-17]。基于對熒光量子點及分子印跡技術的認識，本文將分子印跡技術的高選擇性與量子點熒光檢測技術的高靈敏性相結合，構建分子印跡熒光識別傳感器(MIP-CDs)，用于快速識別呋喃妥因。MIP-CDs可以選擇性地識別呋喃妥因及其作用位點相同的代謝物，當電子在碳量子點和目標分子之間傳遞時，MIP-CDs發生熒光猝滅[1]。根據MIP-CDs的猝滅程度與目標分子濃度的線性關系，建立了一種具有高選擇性和高靈敏度的快速檢測呋喃妥因及其代謝物的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55分子熒光光度計(美國PerkinElmer公司)；FTIR-Tracer 100傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)；DZF-6050D 真空干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)；766-3遠紅外輻射干燥箱(上海錦屏儀器儀表有限公司)；H/T18MM臺式高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；ZEISS EVO18鎢燈絲掃描電鏡(德國蔡司)。

無水檸檬酸(99.5%)、N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS，96%)、呋喃妥因(98%)、呋喃唑酮(98%)、呋喃西林(98%)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，99%)，以上試劑均購于上海阿拉丁生化科技有限公司；正硅酸乙酯(TEOS)；乙腈(色譜純)，氨水，無水乙醇，甲醇，N-N二甲基甲酰胺(DMF)，乙酸，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，檸檬酸一水化合物，以上試劑未注明純度均為分析純；超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1CDs的制備碳量子點的制備方法在參考文獻[7]的基礎上作進一步優化。簡要步驟如下：準確稱取1.0 g無水檸檬酸和20 mL N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)于50 mL反應釜中，通氮除氧15 min后，放入遠紅外干燥箱于200 ℃下反應1 h，得到硅包裹的熒光碳量子點。將熒光碳量子點冷卻至室溫，離心分離，上層清液用無水乙醇定容至250 mL，避光低溫保存備用。

1.2.2MIP-CDs的制備MIP-CDs的合成示意圖如圖1。在100 mL圓底燒瓶中加入200 mg呋喃妥因(模板分子)、350 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(功能單體)和10 mL無水乙醇，超聲30 min使其預聚合。再加入1.5 mL TEOS(交聯劑)、40 mL碳量子點溶液、200 μL氨水和800 μL超純水，室溫下攪拌反應20 h。反應完成后，將產物離心分離，得到的固體用洗脫液甲醇-乙酸(7∶3,體積比)多次洗滌，至洗脫液檢測不到呋喃妥因。將產物50 ℃真空干燥，即得 MIP-CDs。為便于比較，除了不加呋喃妥因模板分子，按相同的方法制備非印跡熒光碳量子點(NIP-CDs)。

1.3 MIP-CDs的熒光響應性能研究

準確配制10 mg/L MIP-CDs 和NIP-CDs溶液，超聲分散后分別用分子熒光光度計在其最大激發波長下測定，并記錄其熒光發射光譜和熒光強度F0。用50 mmol/L磷酸緩沖溶液配制一系列不同濃度的呋喃妥因標準溶液，取1 mL呋喃妥因標準溶液分別加入10 mL MIP-CDs和NIP-CDs溶液，室溫下振蕩20 min，離心分離后，取其清液再次測定熒光強度F。通過改變呋喃妥因的濃度、溶液的pH值等系列吸附實驗探索MIP-CDs對呋喃妥因的熒光傳感性能。

圖1 MIP-CDs的合成路線Fig.1 Synthetic route of the preparation of MIP-CDs

1.4 實際樣品分析

圖2 CDs(a)和MIP-CDs( b)的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of CDs(a)and MIP-CDs(b)

圖3 CDs(A)與MIP-CDs(B)的掃描電鏡圖 Fig.3 SEM images of CDs(A) and MIP-CDs(B)

飼料樣品: 準確稱取 2.0 g 某市售品牌飼料樣品于離心管中，加入10 mL 乙腈，旋渦振蕩混勻10 min，然后超聲提取30 min，高速離心 10 min，取上清液備用。取 1.0 mL提取液用50 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.5)定容至10 mL。取1.0 mL 加入10 mL MIP-CDs溶液中，振蕩吸附20 min，用分子熒光光度計測定吸附前后溶液的熒光強度。

實際水樣: 取周邊村民的魚塘水樣，過 0.45 μm 濾膜，取10 mL 濾液，與飼料樣品同法處理。

圖4 MIP-CDs的熒光譜圖(A)以及MIP-CDs和NIP-CDs對呋喃妥因的時間響應性能(B)Fig.4 Fluorescence spectra of MIP-CDs(A) and time responses of MIP-CDs and NIP-CDs for the detection of nitrofurantoin(B)

2 結果與討論

2.1 化合物的結構及形貌表征

2.1.2掃描電鏡分析圖3A為CDs的掃描電鏡圖，從圖中可知，碳量子點的粒徑細小而均勻，顆粒大小約為10 nm；圖3B為MIP-CDs的掃描電鏡圖，從圖中可見MIP-CDs粒徑比CDs大，顆粒大小約為50 nm，碳點表面包覆的MIP涂層清晰可見，說明MIP成功包覆在CDs的表面。

2.2 MIP-CDs熒光傳感器響應性能研究

2.2.1響應時間分析響應時間是傳感器的重要考察因素之一。本研究考察了MIP-CDs對呋喃妥因的響應時間。圖4A為5 mg/L MIP-CDs的熒光譜圖，其最大激發波長為370 nm，最大發射波長為450 nm。由圖4B可看出，將呋喃妥因加入MIP-CDs的0～20 min內，溶液的熒光強度降低較多，20 min后熒光強度降低值趨于平緩，且MIP-CDs的熒光強度降低值明顯比NIP-CDs大。這說明0～20 min，大量的呋喃妥因分子與MIP-CDs上的量子點相互作用，導致其熒光強度明顯下降；20 min 后，印跡空穴趨于飽和，達到吸附平衡，MIP-CDs的熒光強度基本趨于穩定。因此，選用20 min作為后續MIP-CDs分析的最佳響應時間。

2.2.2檢測液pH值優化由于呋喃妥因和MIP-CDs材料富含氮原子，檢測液pH值會影響氮原子的存在形式，進而影響熒光傳感器對呋喃妥因的識別性能[1]。本研究考察了pH 5.0～9.0條件下MIP-CDs對呋喃妥因的吸附效果。結果表明，在pH 6.0～8.0的酸度條件下，MIP-CDs對呋喃妥因的吸附效果相差不大，但pH≤5.0或pH≥9.0時，MIP-CDs對呋喃妥因的吸附效果較差。當pH≤5.0時，MIP-CDs主要通過疏水作用對呋喃妥因進行吸附，此時呋喃妥因和熒光材料中的氮原子均被質子化而產生電荷間排斥作用，減弱了MIP-CDs對呋喃妥因的吸附能力。隨著 pH 值的升高，質子化程度減弱，電荷排斥作用減小，因此萃取性能提高。隨著 pH 值的繼續增加，氮原子完全去質子化，此時除了疏水作用外，熒光材料的印跡位點與目標分子還存在氫鍵作用力，使MIP-CDs對呋喃妥因的識別能力進一步增強。但當pH≥9.0時，溶液中過多的OH-會嚴重削弱氫鍵作用，導致萃取性能下降[1]。故實驗選擇檢測液pH值為7.5。

2.2.3MIP-CDs熒光傳感器對不同濃度呋喃妥因的識別性能MIP-CDs對呋喃妥因的識別機理為：當目標分子進入MIP空穴時，目標分子與印跡位點相結合，MIP-CDs上的量子點電子傳遞給目標分子，導致量子點熒光發射強度減弱，發生熒光猝滅現象。MIP-CDs的熒光猝滅程度與目標分子的濃度符合Stern-Volmer方程[7]：F0/F=KsvCq+1。其中，F0為初始熒光強度；F為加入目標分子后的熒光強度；Ksv為Stern-Volmer常數；Cq為呋喃妥因的濃度。

考察了質量濃度為0～10 mg/L的呋喃妥因對MIP-CDs熒光猝滅的影響。結果顯示，隨著呋喃妥因濃度的增加，MIP-CDs的熒光強度逐漸降低；呋喃妥因質量濃度在0～10 mg/L范圍內與熒光強度的關系符合Stern-Volmer方程：F0/F=KCq+1，呋喃妥因濃度和[(F0/F)-1]之間呈良好的線性關系，線性方程為(F0/F)-1=0.484 4C-0.048 2，相關系數(r2)為0.991 4，方法檢出限(S/N=3)為2 μg/L。結果表明，MIP-CDs對呋喃妥因具有良好的響應性能，根據MIP-CDs的熒光猝滅程度來計算溶液中呋喃妥因的濃度是可行的。

2.2.4MIP-CDs的選擇性研究選取呋喃唑酮、呋喃西林兩種常見的硝基呋喃類獸藥作競爭底物，考察了MIP-CDs對呋喃妥因的選擇性能。取2 mg/L的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃西林標準溶液各1 mL，分別加入10 mL MIP-CDs和NIP-CDs溶液中，置于恒溫搖床中，室溫下振蕩吸附20 min。離心分離后，分別用分子熒光光度計測定吸附前后的熒光強度F0和F。實驗結果顯示，呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃西林均能使MIP-CDs和NIP-CDs產生一定程度的熒光猝滅，但呋喃妥因對MIP-CDs的猝滅效果明顯優于呋喃西林和呋喃唑酮；而3種物質對NIP-CDs產生的熒光猝滅程度相差不大。其主要原因在于NIP-CDs對3種目標物只存在物理吸附，而MIP-CDs對呋喃妥因除了物理吸附外，還存在與其分子結構相匹配印跡位點的氫鍵作用等化學吸附。

2.3 方法的可行性與實際應用

表1 呋喃妥因的加標回收率與相對標準偏差(n=5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations of FNT for spiked samples(n=5)

用該方法測定魚塘水體和飼料提取液均未檢出呋喃妥因。為了考察MIP-CDs在實際樣品中的分析能力，采用樣品加標試驗對分析方法進行考察，測定了飼料和實際水樣中3個濃度水平加標量(1.0、3.0、5.0 mg/L)的回收率。從表1結果可見，在不同加標濃度的飼料和魚塘水樣中均取得了較好的回收率，呋喃妥因的加標回收率為78.0%～95.2%，相對標準偏差(RSD)均不大于6.4%，符合分析方法學要求，說明該方法可以用于水體及飼料樣品中痕量呋喃妥因的檢測。

3 結 論

本研究將分子印跡技術的高選擇性和碳量子點的高靈敏度相結合，建立了一種新的分子印跡熒光傳感器用于快速識別復雜樣品中的呋喃妥因。以檸檬酸為碳源，采用水熱合成法制備碳量子點。通過硅烷化試劑氨基改性后，利用表面分子印跡技術在改性的碳量子點表面修飾一層分子印跡涂層。所制備的分子印跡碳量子點熒光傳感器對呋喃妥因具有很好的特異性識別能力，并成功應用于水體和飼料樣品中呋喃妥因的檢測。

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