漂浮固化分散液液微萃取/液相色譜法測定人體尿液中的6種羥基多環(huán)芳烴

李 佩，崔君濤，郭溪香，曾祥英，于志強*

(1．中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所 有機地球化學(xué)國家重點實驗室 廣東省環(huán)境資源利用與保護重點實驗室，廣東 廣州 510640；2．中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

多環(huán)芳烴(PAHs)廣泛存在于環(huán)境中，主要來源于化石燃料、生物質(zhì)等有機物質(zhì)的不完全燃燒[1]。PAHs具有致癌、致畸和致突變效應(yīng)，對人體健康和生態(tài)系統(tǒng)具有危害作用[2-3]。20世紀70年代，美國環(huán)保署(USEPA)將16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物。我國也將7種PAHs列入“優(yōu)先污染物黑名單”。近年來，人體暴露于多環(huán)芳烴已受到了廣泛關(guān)注[3-6]。

人們可通過呼吸空氣、攝入灰塵和食物、皮膚吸收等多種途徑暴露于PAHs[4,7]。進入人體的PAHs在P450酶的作用下，通過Ⅰ相代謝反應(yīng)生成羥基化代謝物，也可繼續(xù)通過Ⅱ相代謝反應(yīng)與葡萄糖苷酸或/和硫酸酯結(jié)合形成水溶性更強的結(jié)合態(tài)代謝物，繼而通過人體尿液或糞便排出體外[8]。人體尿液中的羥基多環(huán)芳烴(OH-PAHs)被廣泛用作人體暴露于PAHs的生物標志物，其中1-羥基芘(芘的代謝物)是最常用的生物標志物。但研究表明，同時檢測尿液中多種羥基多環(huán)芳烴對于全面評估人體暴露于PAHs非常有必要[9-10]。隨著流行病學(xué)的發(fā)展，大樣本量尿液的檢測需求也對尿液中代謝物的檢測方法提出新的要求。因此，建立同時檢測尿液中的多種OH-PAHs的簡單快速的分析方法具有重要意義。

目前，分析尿液中OH-PAHs的前處理方法有固相萃取[11-12]、在線固相萃取[13]、液液萃取[14]、攪拌棒吸附萃取[15]等，它們常與液相色譜/熒光檢測器(LC/FLD)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)等檢測技術(shù)聯(lián)合分析尿液中的多種OH-PAHs。盡管這些方法均能基本滿足檢測需求，但對于大樣本量尿液的檢測有一定的局限性。如固相萃取的有機溶劑用量大，在線固相萃取和攪拌棒吸附萃取需特定的實驗裝置，成本較高等。2006年，Assadi等[16]開發(fā)了液液分散微萃取的方法提取水溶液中的痕量有機物，該方法具有操作簡單快速等優(yōu)點。但由于需收集萃取管底部的萃取劑，當樣品基質(zhì)較復(fù)雜時，收集過程帶來的雜質(zhì)干擾較多。因此，Yamini等[17]提出漂浮固化液液微萃取技術(shù)(DLLME-SFO)，該方法使用低毒性的萃取劑，在低溫下凝固后漂浮在萃取管表層，易于收集。目前，此方法已成功用于水[18]、化妝品[19]和尿液[20]等液體樣品基質(zhì)中痕量有機物的測定。本文首次使用DLLME-SFO方法萃取尿液中6種OH-PAHs，并結(jié)合液相色譜/熒光檢測器(LC/FLD)技術(shù)，測定了人體尿液中的2-羥基萘(2-NAP)、2-羥基芴(2-FLU)、2-羥基菲(2-PHE)、3-羥基菲(3-PHE)、4-羥基菲(4-PHE)和1-羥基芘(1-PYR)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

6種OH-PAHs標樣：2-NAP、2-FLU、2-PHE、3-PHE、4-PHE和1-PYR(50 mg/L，溶于甲苯)均購自美國Supelco公司；β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯混合酶(124400β-glucuronidase unit/mL,36010 sulfatase unit/mL)(美國Aldrich-Sigma公司)；氯化鈉、醋酸鈉和冰醋酸均為色譜純(99.97%，美國Tedia公司)；鹽酸(質(zhì)量分數(shù)37%，德國Sigma-Aldrich公司)；正十一醇、甲醇和乙腈均為色譜純(99.9%，德國Merck公司)；丙酮(農(nóng)殘級,99.0%，美國Honeywell公司)；實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)，由銳思捷科學(xué)儀器有限公司的實驗室超純水系統(tǒng)制備。

安捷倫1200型高效液相色譜配備熒光-二極陣列管檢測器(HPLC/FLD,美國Agilent公司)；液相分析柱(Eclipse Plus-C18250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm;美國Agilent公司)；離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1標準儲備液配制將OH-PAHs單標均溶于甲苯，質(zhì)量濃度均為50 mg/L，作為儲備液；使用微量取樣針取不同體積的OH-PAHs各單標儲備液，用甲醇逐級稀釋至所需濃度。

1.2.2尿液的酶解尿液從冷藏室取出后放至室溫，3 000 r/min離心后，準確移取上層清液5 mL，于10 mL具塞玻璃離心管中，加0.5 mL 1.0 mol/L的鹽酸和1.5 mL 0.5 mol/L醋酸鈉和醋酸的緩沖溶液，調(diào)節(jié)尿液的pH值為5.0；然后加20 μLβ-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶，混勻后置于恒溫振蕩箱中避光振蕩16 h，恒溫37 ℃，振蕩速度100 r/min。尿液的酶解使尿液中呈葡萄糖苷酸/硫酸酯結(jié)合態(tài)的代謝物水解形成羥基代謝物。

1.2.3漂浮固化分散液液微萃取酶解后的尿液加入20%的氯化鈉(質(zhì)量分數(shù))調(diào)節(jié)離子濃度。取混合均勻的萃取劑(40 μL 正十一醇)和分散劑(400 μL 丙酮)，快速注入已處理好的尿樣中，使之迅速形成三相渾濁的溶液，渦旋混勻后，離心5 min(3 000 r/min)，此時，密度較輕的正十一醇形成一微小液滴懸浮于液體表面，然后將樣品置于-20 ℃冰箱中冷凍約10 min，待正十一醇固化后，將其取出至進樣細胞瓶中，室溫下溶解后進液相色譜檢測。

1.2.4儀器分析液相色譜分析柱采用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)。采用甲醇(A)-水(B)梯度洗脫：0 ～5 min，60%A；5 ～14 min，60%～78%A；14 ～21 min，78%～85%A；21 ～30 min,85%～100%A；30 ～35 min,100%A；35 ～39 min，100%～60%A；39 ～45 min,60%A。流速為0.6 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為5 μL。各目標化合物的最佳熒光條件分別為(激發(fā)波長/發(fā)射波長)：2-NAP (227/355 nm)、2-FLU (272/336 nm)、2-PHE (254/369 nm)、3-PHE (250/358 nm)、4-PHE (246/371 nm)、1-PYR (239/392 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1萃取劑的影響該漂浮固化分散液液微萃取的萃取劑需滿足以下條件：同時溶于分散劑和尿液，密度比水小，凝固點較高，熔點較低。文獻中常用高醇(如壬醇、癸醇、十一醇和正十二醇)作為萃取劑。正十一醇具有較低的水溶性，萃取過程中穩(wěn)定且具有很好的萃取效果[17-18,21]。因此本研究采用正十一醇作為萃取劑。

圖1 萃取劑體積對萃取效率的影響Fig.1 Effect of the volume of extraction solvent (1-undecanol) on peak areas of OH-PAHs

萃取劑的體積是影響化合物萃取效率和富集倍數(shù)的關(guān)鍵因素。實驗考察了正十一醇的體積分別為30、40、50、60、70 μL時對OH-PAHs萃取效率的影響,結(jié)果如圖1所示。實驗過程中發(fā)現(xiàn)當正十一醇的體積在30 μL及以下時，固化的上浮溶劑體積太小，很難被收集。當體積增加至40 μL時，各化合物的萃取效率明顯提升,當繼續(xù)增加萃取劑的體積時，對PHE和PYR代謝物的萃取效果影響較小，而2-NAP和2-FLU的回收率有所增加，這可能由化合物的極性所致，2-NAP和2-FLU的極性大于PHE和PYR的代謝物，因此更易溶于正十一醇。另外，萃取劑的使用體積增大，目標物的富集倍數(shù)減小，從尿液中帶來的基質(zhì)干擾也增大。因此選擇40 μL正十一醇為萃取劑。

2.1.2分散劑的影響分散劑須滿足以下條件：能與尿液和萃取劑形成三相互溶的乳濁狀液體，增加化合物和萃取劑的接觸面積，以利于尿液中OH-PAHs更好地溶于萃取劑中。實驗考察了甲醇、乙腈和丙酮3種溶劑作為分散劑時對OH-PAHs萃取效率的影響(圖2)，發(fā)現(xiàn)丙酮作為分散劑的效果最好，這可能是由于丙酮的混溶性比其它兩種溶劑更好。

不同體積的分散劑影響三相乳濁狀液體的分散程度，分散劑太少不利于乳濁狀的形成，分散劑過多不利于OH-PAHs溶于萃取劑，因此實驗考察了分散劑的體積分別為200、300、400、500、600 μL時對目標物萃取效率的影響，結(jié)果顯示，當分散劑體積為400 μL時，各目標物的萃取效果最好。

圖2 分散劑種類對萃取效率的影響Fig.2 Effect of the type of dispersive solvent on peak areas of OH-PAHs

2.1.3尿液pH值的影響通過調(diào)節(jié)尿液的pH值，增加或減少尿液中質(zhì)子的總量，優(yōu)化OH-PAHs在溶液中以分子或離子狀態(tài)存在的比例，可能有利于OH-PAHs的萃取。通過添加0.1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)尿液的pH值范圍為2.0 ～9.0，考察了pH值對萃取率的影響，結(jié)果如圖3所示。在pH 5.0時，即酶解后不調(diào)節(jié)尿液的pH值，萃取效果最佳。這與文獻中報道的用攪拌吸附萃取OH-PAHs的條件一致[15]。

圖3 尿液pH值對萃取效率的影響Fig.3 Effect of the pH value on peak areas of OH-PAHs

2.1.4鹽濃度的影響在尿液中添加鹽溶液增加尿液中的離子強度，有利于OH-PAHs以分子形式存在于尿液中，能更好地溶于萃取劑。實驗考察了分別添加質(zhì)量分數(shù)為5%、10%、15%、20%、25%的NaCl對目標物萃取效率的影響，結(jié)果顯示，當添加20%的NaCl時，各化合物的萃取效果最好。

2.1.5萃取時間的影響在注入分散劑和萃取劑后，尿液迅速形成渾濁的液體，實驗比較了萃取時間分別為0 (不靜置，直接離心)、2、5、10 min時對目標物萃取效率的影響。結(jié)果顯示，萃取時間對化合物的萃取效率無影響。表明液液分散萃取過程非常迅速，在分散劑和萃取劑注入形成渾濁液體后，目標物即被萃取出來。

2.2 方法評價

方法評價中所用的尿液基質(zhì)為采集的10例志愿者尿液等體積混合后的尿液。本方法的回收率采用標準加入法進行考察，由于混合尿液基質(zhì)中廣泛存在OH-PAHs，因此同時進行加標基質(zhì)和空白基質(zhì)的前處理，每個加標濃度進行6次重復(fù)實驗。結(jié)果顯示，所有目標化合物在10、50、250 μg/L加標濃度下的回收率為70.4%～129%，相對標準偏差(RSD)為1.7%～14.8%，方法的準確度和精密度可滿足尿液中OH-PAHs的分析要求(表1)。其中2-NAP在10 μg/L加標水平時，檢測的波動稍大，這可能由于低濃度下的基質(zhì)干擾較大。分別以3倍信噪比計算得檢出限(LOD)為0.5 ～1.0 μg/L，以10倍信噪比計算得定量下限(LOQ)為1.5 ～3.0 μg/L，所有目標化合物在2.5～150.0 μg/L范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 1～0.999 8(表2)。方法的靈敏度可滿足實際樣品的檢測需求。

表1 不同加標濃度下各OH-PAHs的回收率和相對標準偏差(n=6)Table 1 Recoveries and RSDs of OH-PAHs in human urine spiked at different concentrations(n=6)

表2 DLLME-SFO方法檢測尿液中OH-PAHs的線性關(guān)系、重復(fù)性、檢出限與定量下限Table 2 Analytical performance data for determination of OH-PAHs in urine by DLLME-SFO method

xrepresents the response area,yrepresents the quality of analyte

2.3 與其他方法的比較

該方法與文獻報道方法的比較見表3，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的固相萃取[23-24]和自動液液萃取[14]相比，該方法無需特殊的實驗裝置，前處理時間短。雖然本方法的檢出限高于使用質(zhì)譜檢測方法的檢出限[14,23]，但熒光檢測器對于大多數(shù)實驗室來說，價廉易得，有利于方法的推廣使用。該方式使用的萃取劑正十一醇僅需幾十微升，且?guī)缀鯚o毒，對環(huán)境友好，減少了對實驗人員的健康危害。總之，相比于文獻方法，該方法簡單快速，靈敏度高，可滿足尿液中OH-PAHs的檢測需求；易于推廣，對大樣本量尿液中的OH-PAHs檢測具有應(yīng)用前景。

表3 本研究方法和已報道方法的比較Table 3 Comparison of various analytical methods for the detection of OH-PAHs in urine

a:6-Chr represents 6-bydroxychrysene

2.4 實際樣品的檢測

隨機采集實驗室17位志愿者的尿液樣本，每個樣本約10 mL，使用本方法進行檢測，目標化合物的濃度使用肌酐值進行校正(表4)。除了4-PHE的檢出率僅為58%，其它化合物的檢出率均達到80%以上。2-NAP是最主要的檢出化合物，最高濃度達到16.78 μmol/mol肌酐。證實該方法可用于人體尿液中OH-PAHs的檢測。

表4 實際人體尿液中OH-PAHs的濃度Table 4 Concentrations of OH-PAHs in human urine(n=17) (μmol/mol肌酐)

3 結(jié) 論

本文建立了漂浮固化分散液液微萃取的方法，富集人體尿液中多種PAHs代謝產(chǎn)物，并通過液相色譜/熒光檢測器(LC/FLD)進行檢測。該方法顯示了很好的萃取效果，操作簡單快速，可滿足人體尿液中6種羥基多環(huán)芳烴的分析需求，為流行病學(xué)上大樣本量尿液中OH-PAHs的檢測提供了參考方法。

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本研究采用 UPLC-MS/MS 法同時測定慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激模型大鼠腦脊液樣品中 5-羥色胺和 5-HIAA 的濃度，該方法簡單、快速，可用于腦脊液中 5-羥色胺和 5-HIAA 的含量測定。

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