固相萃取/超高效液相色譜-質譜法篩查及檢測養魚河水中抗生素

程家興，趙起越，李令軍，杜振霞*，郭巧珍,3，沈正超

(1.北京化工大學 理學院，北京 100029；2.北京市環境保護檢測中心，北京 100048；3.北京市疾病預防控制中心 北京市食物中毒溯源診斷重點實驗室，北京 100013)

養殖業普遍存在以獸用抗生素治療各種因細菌真菌感染產生的疾病的現象[1]，部分企業甚至在動物飼料中直接添加獸用抗生素以達到增產的目的[2-3]。2012年美國和韓國開始規范飼料中抗生素的使用[4],但我國并沒有嚴格的立法限制，導致養殖業濫用抗生素問題嚴重[5]。水產養殖直接使用抗生素會導致周圍水環境受到污染，并且抗生素在不同環境中的化學行為也不一致[6]。Pomati等[7]的研究結果顯示，水體中四環素或紅霉素等抗生素會嚴重抑制淡水單細胞藻類的生長。常用的氯霉素可引起再生障礙性貧血，大環內酯類、磺胺類等具有抗原性，可引起人體的過敏反應[8]，直接影響人類以及其它動植物用水安全。

抗生素的常用檢測方法有高效液相色譜-紫外/熒光(HPLC-DAD/FLD)[9-10]法、液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)[11-13]法等。有文獻報道[14]使用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(UPLC-Q-TOF MS)對牛奶中的抗生素進行分析,但無法檢測到實際樣品中的痕量物質(ng/L)。

而對北方地區養魚業中抗生素的使用情況及其對周圍地表水環境影響的研究，目前幾乎沒有相關文獻。本實驗首次使用UPLC-Q-TOF MS結合UPLC-MS/MS對養魚河水中抗生素進行快篩和痕量分析(ng/L)，彌補了TOF靈敏度不高、定量準確度較差,以及三重四極桿質譜MRM模式只能對目標化合物進行分析的缺陷。與地下水及自來水相比，養魚河水成分復雜，基質效應更加嚴重。與其他文獻報道[15-17]相比，本實驗著重優化了水樣的前處理條件，在富集凈化4大類15種抗生素的同時具備較高的回收率及較小的基質效應。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQ-XS 三重四極桿質譜儀、Waters Xevo G2-S 四極桿飛行時間質譜(美國Waters 公司)；12位防交叉污染固相萃取儀(美國Supelco公司)；MTN-2800D 12位手動氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；FE20 pH 計(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL，美國 Waters公司)。

甲醇、乙腈為色譜純(美國 Fisher 公司)；甲酸為色譜純(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；鹽酸為分析純(北京化工廠)；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

0.45 μm玻璃纖維濾膜、0.22 μm尼龍濾膜(天津津騰實驗有限公司)。

1.2 標準溶液配制

準確稱取1 mg(精確至0.01 mg) 15種抗生素標準品，用含0.1%甲酸的甲醇配制成質量濃度為1 g/L的標準溶液保存于-20 ℃的冰箱中，使用時以初始流動相稀釋。

1.3 樣品采集

在養魚池及其附近河流設置采集點，每個采樣點采集2.5 L河水于褐色玻璃瓶中密封避光保存，在4 ℃下冷藏，24 h內完成測定。

1.4 樣品前處理

1.4.1水樣品過濾在室溫下，水樣用0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾后準確量取500 mL于1 L玻璃燒杯中，用鹽酸調至pH 4.0，加入0.5 g Na2EDTA，充分混勻，待上柱凈化、富集。

1.4.2固相萃取依次用6.0 mL甲醇、6.0 mL超純水(pH 4.0)活化HLB固相萃取柱。樣品以約3 mL/min的流速通過柱子，用6 mL超純水淋洗，真空泵抽干。干燥后，分別用4 mL甲醇和4 mL含0.1%甲酸的甲醇洗脫。將洗脫液收集于10 mL離心管中，氮氣吹掃至近干，然后用初始流動相復溶至0.50 mL，過0.22 μm濾膜，待上機測定。

1.5 儀器條件

1.5.1色譜條件色譜柱：BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國 Waters 公司)；進樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；流動相：A為甲醇；B為 0.1%(體積分數)甲酸水溶液。

ESI正離子模式梯度洗脫程序(流速0.35 mL/min)：0～1.00 min，5%A；1.00～2.00 min，5%～20%A；2.00～6.50 min，20%～34%A；6.50～7.00 min，34%～95%A；7.00～7.50 min，95%A；7.50～8.00 min，95%～100%A；8.00～8.30 min，100%A；8.30～8.40 min，100%～5%A；8.40～10.00 min，5%A。

ESI負離子模式梯度洗脫程序(流速0.30 mL/min)：0～1.00 min，5%A；1.00～2.00 min，5%～40%A；2.00～5.00 min，40%～45%A；5.00～5.10 min，45%～95%A；5.10～5.50 min，95%～5%A；5.50～7.00 min，5%A。

1.5.2飛行時間質譜儀條件電離模式：ESI+/ESI-；檢測模式：MSE；毛細管電壓：3 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔電壓：30 V，碰撞能量20～40 eV；LockSpray：m/z556.2776，每30 s切換一次進行質量數校正。

1.5.3三重四極桿質譜儀條件電離模式：ESI+/ESI-；檢測方式：多反應監測(MRM)模式。優化后的質譜條件見表1。

表1 15種抗生素的質譜條件Table 1 MS/MS conditions of the 15 antibiotics

2 結果與討論

2.1 前處理條件優化

2.1.1固相萃取柱的選擇結合文獻[13,18]的報道，本實驗比較了HLB固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱的效果。實驗結果顯示，后者對四環素類、磺胺類的回收率均遠低于前者，例如與Sep-Pak C18固相萃取柱相比，TC在HLB固相萃取柱上回收率提高了30%，SDZ在HLB固相萃取柱上回收率提高了21%。而對于氯霉素類和喹諾酮類抗生素，HLB固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱的回收率相差不大。

進一步對6 mL/500 mg和3 mL/60 mg兩種規格的HLB固相萃取柱進行對比，發現6 mL/500 mg對磺胺類的回收率更高，而且與3 mL/60 mg 相比TC回收率從原來的45%提高到65.3%，而DC則從原來的70%提高到82.5%。兩種規格HLB柱對喹諾酮類和氯霉素類的回收率無太大差異。原因是上樣體積大時3 mL/60 mg規格的固相萃取柱容易過載。因此選用體積容量較大的6 mL/500 mg的HLB固相萃取小柱。

2.1.2水樣pH值的調節部分抗生素樣品在堿性環境中不能穩定存在，用鹽酸調節樣品pH值至2.0和4.0，分別比較原樣品與pH 2.0和pH 4.0時的回收率。將pH值調至4.0時，磺胺類的回收率可從不調節pH值的61.2%增至70.9%，四環素類和喹諾酮類的回收率也均有明顯提高，而當pH值調至2.0時，一些喹諾酮類抗生素的回收率略有下降。pH值對氯霉素類抗生素的影響不大。綜合考慮，本實驗選擇調節水樣品pH值為4.0。

2.1.3上樣體積的選擇實驗比較了500 mL和1 000 mL上樣體積的回收率，發現使用500 mL上樣體積時，氯霉素類和磺胺類抗生素的回收率略有提高，喹諾酮類和四環素類抗生素的回收率明顯提高，例如上樣體積從1 000 mL減少至500 mL時，NOR從30%提高到73.6%。上樣體積太大可能使水樣品中雜質吸附在固相萃取柱填料上或超載，導致喹諾酮類和四環素類抗生素回收率下降，因此實驗選用的上樣體積為500 mL。

2.1.4洗脫溶液的選擇實驗比較了純甲醇和含0.1%甲酸甲醇的洗脫效果。結果顯示，以純甲醇洗脫時，DC、TC、NOR、ENR的回收率比用0.1%甲酸甲醇洗脫時平均低10%左右。但純甲醇洗脫時CIP和OTC的回收率略高于0.1%甲酸甲醇洗脫時的回收率。氯霉素類和磺胺類抗生素的回收率則差別不大。綜合考慮使用純甲醇和0.1%甲酸甲醇分別進行洗脫，以提高回收率。

2.1.5洗脫體積的選擇分別選用3 mL甲醇和3 mL 0.1%甲酸甲醇、4 mL甲醇和4 mL 0.1%甲酸甲醇、5 mL甲醇和5 mL 0.1%甲酸甲醇進行洗脫，發現4 mL甲醇和4 mL 0.1%甲酸甲醇與5 mL甲醇和5 mL 0.1%甲酸甲醇的回收率差別不大，且對喹諾酮類和磺胺類抗生素的回收率均高于3 mL甲醇和3 mL 0.1%甲酸甲醇，例如使用3 mL甲醇和3 mL 0.1%甲酸甲醇洗脫時OFL的回收率為59%，使用4 mL甲醇和4 mL 0.1%甲酸甲醇洗脫時回收率提高到70.6%。故選用4 mL甲醇和4 mL 0.1%甲酸甲醇進行洗脫處理。

2.2 基于UNIFI軟件建立抗生素數據庫

利用ChemSpider專業化學數據庫整理生活中常用的103種抗生素的mol文件，將其導入UNIFI軟件中。建立包含名稱、分子式、結構式、精確質量數、特征離子、中性丟失、可能的MS/MS裂解規律等信息的 UNIFI抗生素數據庫。利用該數據庫對經UPLC-Q-TOF MS分析后的水樣數據進行快速篩查。篩查條件為質量偏差小于10 mDa。由于缺少全部的抗生素標準品在色譜柱的保留時間數據，在篩查完成后，對篩查到的抗生素，購買標準品后通過三重四極桿質譜進行準確的定性定量分析。

2.3 儀器條件的優化

2.3.1色譜條件優化甲酸是在ESI+模式下增強被測物質離子化程度的常用試劑，同時能夠有效改善峰形，使峰形更加尖銳。因此選擇含0.1%甲酸的水溶液作為流動相B。由于本實驗的抗生素用甲醇溶液配制，因此選用甲醇作為流動相A。

2.3.2三重四極桿質譜條件優化抗生素標準品在全掃描模式下直接進樣，以從小到大的方式改變錐孔電壓，由產生的峰高判斷每種抗生素最合適的錐孔電壓并確定母離子的相對分子質量，經子離子掃描選擇最優的兩對子離子的質量數及最佳碰撞能量。為了進一步提高反應的靈敏度，采用多時段多離子反應監測模式。15種抗生素的色譜圖如圖1所示。

2.4 線性范圍與檢出限

將“1.2”配制的標準溶液用初始流動相稀釋成一系列不同質量濃度的溶液，以質量濃度為橫坐標(x，μg/L)，峰面積為縱坐標(y)，繪制15種抗生素的標準曲線(表2)。除了金霉素的線性范圍為1.0～50 μg/L，其余抗生素均在0.03～50 μg/L范圍內線性良好，相關系數r≥0.990。在空白水樣中添加15種抗生素，經過“1.4”前處理方法后得到不同抗生素的方法檢出限(MDL，S/N≥3)，見表2。15種抗生素的檢出限為0.01～0.3 ng/L。

將本方法與其他文獻報道的方法進行比較(表3)，結果表明，相較于HPLC，UPLC在保證抗生素分離效果的情況下所需分析時間更短。相同柱長下，本實驗的分析時間較短。本方法對各類抗生素的檢出限均低于或接近其他方法的檢出限，且靈敏度較高。

AnalyteRegressionequationCorrelationcoefficient(r)Linearrange(μg/L)MDL(ng/L)CAPy=5666 43x-4557 350 9990 03～500 01THIy=1825 85x-1301 20 9980 03～500 01FLOy=3405 45x-3387 60 9990 03～500 01SDZy=6483 98x-4494 580 9990 03～500 01SMZy=11095 2x-5280 250 9990 03～500 01TMPy=62495 8x-8666 390 9980 03～500 01NORy=22454 6x-21480 70 9900 03～500 1CIPy=15773x-14557 40 9920 03～500 1ENRy=10256 7x+1632 870 9900 03～500 1OFLy=25211 3x-17702 30 9920 03～500 1TCy=8613 77x-6422 760 9900 03～500 1DCy=15175x+27165 50 9900 03～500 1OTCy=6453 05x-4101 340 9900 03～500 1CTCy=2082 68x-186 90 9931 0～500 3

y：peak area of the target compound;x：mass concentration(μg/L)

表3 本方法與其他方法的比較Table 3 Comparison of this method with other methods

*untested

2.5 回收率與精密度

用河水上游的500 mL水庫水作為空白水樣，分別添加10、30 ng 的1 g/L混合標準溶液，每個加標水平做3個平行，結果見表4。結果表明，15種抗生素的回收率為61.0%～98.4%，相對標準偏差(n=3)為4.6%～14.0%，日內和日間的相對標準偏差分別為6.8% ～ 8.7%和7.2% ～9.8%。

表4 15種抗生素的平均加標回收率和相對標準偏差(n=3)Table 4 Average spiked recoveries and relative standard deviation(RSDs) for the 15 antibiotics at 2 spiked levels(n=3)

2.6 實際樣品分析

表5 水樣的初篩結果Table 5 The detection data of UPLC-TOF MS

the sample numbers were the same as those in Table 6

2.6.1利用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜的快篩利用本研究建立的UPLC-Q-TOF MS方法對10個采樣點的水樣進行了分析，水樣經過“1.4”方法前處理后，用建立的抗生素數據庫對分析結果進行快篩，結果如表5，樣品編號與表6采樣點編號相同。

2.6.2實際樣品的定性定量分析利用本研究建立的UPLC-MS/MS方法對10個采樣點的水樣進行了檢測，結果表明，氯霉素類和喹諾酮類相較于其它類抗生素的檢出率更高，而且在部分采樣點檢出的濃度較高(表6)。對比表5，發現初篩的結果準確性較高，初篩的15種抗生素在實際樣品中均有檢出，其中含量較低的抗生素使用靈敏度較高的三重四極桿質譜才能準確定性定量。

表6 10個采樣點的檢測數據Table 6 The detection data of 10 sampling points (ng/L)

nd：lower than the LOD

3 結 論

有關北方地區水產養殖中獸用抗生素的使用情況研究較為缺乏，本研究前期結合UNIFI軟件建立的數據庫使用UPLC-Q-TOF MS對水樣中的抗生素進行快速篩查，有效避免了使用三重四極桿質譜檢測抗生素的盲目性。再使用UPLC-MS/MS的MRM模式進一步準確定性和定量養魚河水中篩查到的4類(喹諾酮類、氯霉素類、四環素類、磺胺類)15種抗生素，其中氯霉素類和喹諾酮類抗生素的檢出率與檢出濃度較高。優化之后的固相萃取方法有效避免了樣品的基質效應。該方法靈敏度較高，重復性好，可在10 min內快速檢測河流等復雜水環境中的抗生素。

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