血漿游離DNA水平檢測在胃癌診斷、轉移中的應用價值

虞靜芳，李翔翔，沈昊，沈國榮

(蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇蘇州 215000)

胃癌是消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，20%的胃癌首診時已發(fā)生轉移。遠端臟器的轉移會嚴重降低手術和治療效果，導致預后不良，5年生存率降低。近年來，有關游離DNA(cf-DNA)在惡性腫瘤診斷和預后中作用的研究越來越多。Kim等[1]研究發(fā)現(xiàn)，cf-DNA水平在胃癌組中顯著高于對照組，提示cf-DNA定量在胃癌診斷中有一定意義。Umetani等[2]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，淋巴結轉移越多，分期越晚，患者cf-DNA的水平越高，提示cf-DNA定量在判斷腫瘤轉移中可能也有一定的價值。推測cf-DNA檢測可以作為診斷腫瘤和判斷轉移的一個敏感指標。本研究觀察了胃癌患者血漿cf-DNA水平，探討其在胃癌診斷及轉移中的應用價值。現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

收集2015年1月～2016年6月我院原發(fā)性胃癌初診患者81例(胃癌組)，其中男56例、女25例，年齡32～86歲、中位年齡65歲。其中無轉移38例、僅腹部淋巴結轉移26例、遠端臟器轉移17例。胃癌組臨床檢測指標中性粒細胞計數(shù)(NE#)3.55(2.48，4.95)×109/L，淋巴細胞百分比(LY%)0.28(0.22，0.33)，平均血小板體積(MPV)10.70(9.95，11.70)fL，D-二聚體(D-D)0.56(0.17，1.32)mg/L，纖維蛋白原降解產物(FDP)2.20(1.00，5.50)mg/L，前白蛋白(PAB)198.80(157.28，227.53)mg/L，白球比(A/G)1.70(1.50，1.90)，超敏C反應蛋白(hs-CRP)2.09(0.51，8.44)mg/L。按國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(UICC/AJCC)胃癌TNM分期標準(2010)進行分期，入選病例均經組織病理學確診。排除乙型肝炎、HIV等病毒感染性疾病，無系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎等免疫性疾病，無白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤，無急性感染或創(chuàng)傷。選取同期門診體檢健康者43例作為對照組，其中男28例、女15例，年齡35～76歲、中位年齡65歲。胃癌組與對照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義。本研究通過蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會認證，受試者均知情同意。

1.2　血漿cf-DNA檢測

[1].2.1血漿cf-DNA的提取分別取兩組外周血3 mL于EDTA抗凝管中，1 600 r/min離心10 min，取上清后16 000 r/min離心10 min，取上清置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０凑瘴⒘垦夯蚪M提取試劑盒(德國QIAGEN公司，批號：151030957)說明書(QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen)提取cf-DNA，提取分裝后置于-80 ℃保存。

[1].2.2標準品的制備提取人基因組DNA作為標準品，由紫外分光光度計測量其原始濃度，倍比稀釋其濃度至400、40、4、0.4、0.04 ng/mL。內參采用ALU重復序列(115 bp)，引物序列上游:5′-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3′，下游：5′-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3′。根據(jù)標準品的濃度梯度PCR儀自動分析繪制標準曲線，得出標準曲線的回歸方程為Y=-3.368X+16.50，Ct值(循環(huán)數(shù))與模板起始濃度對數(shù)值之間具有較好的線性關系(r=1)。

[1].2.3血漿cf-DNA定量檢測于ABI V7DX實時熒光定量PCR儀上擴增提取的DNA，質粒標準品，陰性對照(ddH2O)，PCR總體系為20 μL：SYBR Green Real Master Mix(北京天根公司，批號：P4412)9 μL，200 nmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL，模板2 μL。反應條件：94 ℃預變性1 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s， 45個循環(huán)，86 ℃ 5 s。根據(jù)質粒標準品的標準曲線對115 bp的ALU內參基因進行定量分析，將Ct值帶入回歸方程得出各樣本的起始模板濃度，每份樣本均做3個復孔，結果取平均值。

1.3　血清CEA、CA724、CA199水平檢測

用促凝管收集患者外周血標本3 mL，4 000 r/min離心10 min取血清進行檢測，腫瘤標志物CEA、CA724、CA199測定采用雅培I2000-2儀器(美國雅培公司)。

1.4　統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)結果以中位數(shù)(M)及四分位數(shù)(P25，P75)表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用非參數(shù)檢驗Kruskal-WallisH檢驗；采用u檢驗比較CEA、CA724、CA199、cf-DNA對胃癌診斷效能的ROC曲線下面積；胃癌發(fā)生遠處轉移的危險因素分析采用單因素和多因素Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1　兩組血漿cf-DNA、CEA、CA724、CA199水平比較

胃癌組血漿cf-DNA水平高于對照組(P<0.01)。胃癌組腫瘤標志物水平均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1　　　　兩組cf-DNA、CEA、CA724、CA199水平比較[M(P25，P75)]

2.2　CEA、CA724、CA199、cf-DNA對胃癌的診斷效能比較

CEA、CA724、CA199、cf-DNA診斷胃癌的ROC曲線下面積分別為0.575、0.531、0.524、0.857，cf-DNA診斷效能較CEA、CA724、CA199高(u分別為4.799、5.670、5.446，P均<0.01)，CEA、CA724、CA199兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義。當cf-DNA值取6.09 ng/mL時，診斷胃癌的敏感性為0.679，特異性為0.932。

2.3　不同臨床病理特征的胃癌患者血漿cf-DNA水平比較

見表2。

表2　　　　不同臨床病理特征的胃癌患者血漿cf-DNA水平比較[M(P25，P75)]

2.4　胃癌發(fā)生遠處轉移的危險因素

對單因素分析篩選出的有意義的因素進行多因素回歸分析，結果表明，血漿cf-DNA水平(OR=4.178,95%CI:1.309～13.332)和PAB水平(OR=0.958,95%CI:0.971～1.000)是胃癌發(fā)生遠處轉移的獨立危險因素(P均<0.05)。見表3。

表3　　　　胃癌發(fā)生遠處轉移的危險因素單因素分析結果

3　討論

循環(huán)cf-DNA是存在于外周血液、腦脊液等體液中的胞外DNA。近年研究發(fā)現(xiàn)，血液中cf-DNA在自身免疫性疾病、炎癥、惡性腫瘤等疾病中都一定程度地升高。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血漿cf-DNA水平是正常人的3～5倍，并且這些cf-DNA存在與腫瘤相關的分子遺傳學改變[1]。在血漿cf-DNA的定量方面，ALU內參基因由于較編碼基因甲基化更少，也更穩(wěn)定[2]，因此本實驗選用115 bp的ALU基因片段對胃癌患者血漿cf-DNA水平進行定量檢測。本研究結果也表明，胃癌組cf-DNA水平高于對照組，與胃癌傳統(tǒng)的腫瘤標志物CEA、CA199、CA724比較，其對胃癌的診斷價值最高，提示cf-DNA可以作為胃癌診斷潛在的腫瘤標志物。

胃癌轉移患者的5年生存率一般低于20%[3～5]，判斷胃癌是否轉移對患者的治療和預后尤為重要。近年研究表明，外周血cf-DNA水平與癌癥的遠處轉移密切相關。Agostini等[6]發(fā)現(xiàn)，cf-DNA水平與乳腺癌淋巴結轉移相關；黃寶麗等[7]的研究也提示，cf-DNA水平與非小細胞肺癌遠處轉移有關。本研究進一步探討了血漿cf-DNA水平和胃癌臨床病理特征的關系，結果表明，cf-DNA水平在胃癌有無轉移之間差異有統(tǒng)計學意義，在無轉移、僅近端淋巴結轉移、遠端臟器轉移三者之間隨病情加重而升高。提示cf-DNA水平可能與機體的腫瘤負荷相關，轉移情況越嚴重，腫瘤細胞釋放或者機體腫瘤負荷狀態(tài)下細胞壞死釋放的DNA片段越多。可見，cf-DNA可作為判斷胃癌轉移的潛在腫瘤標志物。

相關研究表明，臨床檢測指標NE#[8,9]、LY%[8]、MPV[10～12]、D-D[13]、FDP[14]、A/G、PAB、hs-CRP[15]與機體腫瘤負荷相關，這些指標在伴和不伴轉移的腫瘤患者中有顯著差異，提示這些指標在胃癌的轉移、侵襲和進展中可能有一定的應用價值。本研究同時檢測分析這些指標，單因素回歸分析結果表明，NE#、LY%、cf-DNA、PAB是胃癌遠處轉移的危險因素，遠端臟器轉移患者NE#顯著升高。其可能的原因是胃癌轉移引起腫瘤負荷增加，導致患者的慢性炎癥加重，中性粒細胞升高[9]。腫瘤的侵襲擴散破壞機體的免疫功能可能是導致淋巴細胞降低的原因。進一步多因素回歸分析結果表明，cf-DNA和PAB水平是胃癌發(fā)生遠處轉移的獨立危險因素。PAB傳統(tǒng)上是一種營養(yǎng)蛋白質指標，機體在急性炎癥、惡性腫瘤等疾病狀態(tài)下，PAB水平也會有不同程度的降低，但其在腫瘤進展和轉移中的價值沒有得到足夠的認識。本研究提示二者或可以聯(lián)合應用預測胃癌的遠處轉移，評價機體的腫瘤負荷。

綜上所述，胃癌患者血漿cf-DNA水平升高，其可用于胃癌的診斷、轉移判斷。

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