骨碎補(bǔ)乙醇提取物對(duì)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

劉國(guó)巖，郝延科，李國(guó)弼，徐展望，徐琬梨

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué))

傳統(tǒng)中藥骨碎補(bǔ)在促進(jìn)骨折愈合及治療骨質(zhì)疏松癥的臨床應(yīng)用中取得了很好的療效。目前，骨碎補(bǔ)療效機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究多集中于促成骨方面。血液供應(yīng)是骨折愈合和成骨基礎(chǔ)，內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)具有促進(jìn)血管修復(fù)及內(nèi)皮再生的功能；而基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)是造血干細(xì)胞動(dòng)員和歸巢的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞遷移、增殖、動(dòng)員及血管形成等過(guò)程中起重要的作用。2016年9月～2017年7月，我們采用不同濃度骨碎補(bǔ)乙醇提取液培養(yǎng)大鼠EPCs，觀(guān)察其對(duì)EPCs增殖及SDF-1表達(dá)的影響，從血管新生角度探討骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合及治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

6周齡SD大鼠40只，雌雄不限，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)，EGM-2 MV Bulletkit培養(yǎng)基(LONZA)，小鼠單克隆抗體VEGFR-2、兔抗大鼠一抗CD34、CD133抗體(Abcam)，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液(上海麥倉(cāng)生物科技有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Novus公司)，中藥骨碎補(bǔ)(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供)，胰蛋白酶及L-谷氨酰胺(Sigma)。倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，熒光顯微鏡(美國(guó)Nikon公司)，圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Image-Pro Plus)，低溫高速離心機(jī)(Sigma，美國(guó))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱(美國(guó)Forma公司)。

1.2　骨碎補(bǔ)乙醇提取物的制備

將中藥骨碎補(bǔ)600 g加入6 kg 75%乙醇中，回流提取2次，每次2 h。將2次提取液合并，減壓回收乙醇，提取液濃縮至300 mL，骨碎補(bǔ)含量相當(dāng)于2 g/mL，4 ℃保存。使用前在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中加入骨碎補(bǔ)乙醇提取物，分別配制成終濃度20、2、0.2 mg/mL的培養(yǎng)液。

1.3　大鼠EPCs的分離、培養(yǎng)與鑒定

向大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉處死，用75%乙醇浸泡30 min。無(wú)菌條件下分離雙側(cè)股骨并剔凈肌肉及軟組織，剪去骺端，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集沖洗液。加入淋巴細(xì)胞分離液，離心，收集細(xì)胞。加入EGM-2 MV Bulletkit培養(yǎng)基，重懸后接種包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中，放置于5% CO2、飽和濕度條件的37 ℃孵箱培養(yǎng)。將原代貼壁細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2周后的EPCs進(jìn)行雙熒光染色鑒定，以2.5 g/L胰酶+0.1 g/L EDTA消化傳代至24孔板中，待細(xì)胞貼壁完全后，先后與CD133及FLK-1進(jìn)行孵育1 h，在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察。雙熒光染色結(jié)果顯示，EPCs呈CD133及FLK-1雙陽(yáng)性表達(dá)。

1.4　細(xì)胞分組與處理

取傳代細(xì)胞，將細(xì)胞分為5組：①標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組：加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液EGM-2 MV Bulletkit，含15%胎牛血清、VEGF 10 mg/L、青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL；②條件培養(yǎng)基組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中加入地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、VitC 50 μg/mL；③骨碎補(bǔ)高劑量組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中加入20 mg/mL骨碎補(bǔ)乙醇提取液；④骨碎補(bǔ)中劑量組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中加入2 mg/mL骨碎補(bǔ)乙醇提取液；⑤骨碎補(bǔ)低劑量組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中加入0.2 g/mL骨碎補(bǔ)乙醇提取液。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5　細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察

倒置相差顯微鏡下，每日觀(guān)察EPCs生長(zhǎng)、增殖及形態(tài)特征的變化并拍照。

1.6　細(xì)胞增殖能力觀(guān)察

采用MTT法。向細(xì)胞中加入0.25%胰酶消化，體外增殖EPCs并計(jì)數(shù)，按200 μL/孔均勻接種到包被有明膠的96孔培養(yǎng)板，按1.4方法分組培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別于第1、3、5、7天每孔加10 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，加入二甲基亞砜，于微量振蕩器充分振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后，置酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)OD值。

1.7　細(xì)胞SDF-1 mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用RT-PCR方法。將分組培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞移去培養(yǎng)液，提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度。根據(jù)Genbank檢索大鼠SDF-1基因編碼號(hào)NM_0010338277-96，347-370,片段長(zhǎng)度249 bp。SDF-1上游引物5-ACGCCATGGACGCCAAGGTC-3′，下游引物5′-ACACCTCTCACATCTTGAGCCTCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物417 bp；β-actin上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物838 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，以SDF-1條帶與β-actin條帶灰度值的比值計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　EPCs形態(tài)觀(guān)察

各組原代分離出的單個(gè)核細(xì)胞呈體積較小的圓形，加入EGM-2 Bulletkit培養(yǎng)基后第2天細(xì)胞開(kāi)始貼壁，呈類(lèi)似于梭狀形態(tài)的紡錘形，從第6天開(kāi)始呈放射狀向外周生長(zhǎng)，第10天時(shí)呈微血管樣生長(zhǎng)。

2.2　各組細(xì)胞增殖能力比較

見(jiàn)表1。第1、3、5、7天標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組、條件培養(yǎng)基組細(xì)胞OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，骨碎補(bǔ)高、中、低劑量組OD值均高于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組和條件培養(yǎng)基組(P均<0.05)，骨碎補(bǔ)高、中、低劑量組之間OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1　各組細(xì)胞增殖能力比較

注：與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組、條件培養(yǎng)基組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.3　各組SDF-1 mRNA表達(dá)比較

標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組、條件培養(yǎng)基組及骨碎補(bǔ)高、中、低劑量組SDF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.010±0.029、1.088±0.028、1.154±0.021、1.389±0.019、1.125±0.031。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組、條件培養(yǎng)基組SDF-1 mRNA表達(dá)量低于骨碎補(bǔ)各劑量組(P均<0.01)，骨碎補(bǔ)中劑量組高于高、低劑量組(P均<0.05)。

3　討論

中藥骨碎補(bǔ)為骨傷科常用藥物，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛的作用。近年研究[1]顯示，骨碎補(bǔ)能夠通過(guò)促進(jìn)Ⅰ型膠原及核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)的表達(dá)，促進(jìn)骨折愈合及防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。局部微血管生成是骨愈合的基礎(chǔ)，特別是組織再生能力較差時(shí)或存在大范圍骨缺損，通過(guò)促進(jìn)血管形成來(lái)提高骨組織的再生與修復(fù)能力是非常重要的。目前，對(duì)于單味中藥骨碎補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)研究多聚集于促成骨方面，而關(guān)于調(diào)控相關(guān)促血管新生因子促進(jìn)新生血管生成的研究較少。

血管EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有游走性、自我更新及增殖分化的生物學(xué)特性，具有促進(jìn)血管修復(fù)及內(nèi)皮再生的功能，可以發(fā)育和分化為外周血細(xì)胞和血管壁細(xì)胞；同時(shí)具有特異性歸巢的能力，以及增殖、分化、促進(jìn)組織中新生血管形成的能力[2～4]。目前研究[5，6]已表明，激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、促炎因子均可以動(dòng)員調(diào)控血管EPCs增殖和遷移能力，增加新血管生成。當(dāng)組織缺血時(shí)，血管EPCs和細(xì)胞因子均動(dòng)員至缺損區(qū)域，繼而分化成為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管的形成[7，8]。Matsumoto等[9]分離培養(yǎng)外周血中的EPCs進(jìn)行骨缺損修復(fù)，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)血管形成和骨形成，從而增強(qiáng)骨修復(fù)作用，使得EPCs在骨修復(fù)過(guò)程中的重要性得到證實(shí)。Yu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合了EPCs的組織工程骨可通過(guò)有效的血管化促進(jìn)成骨，同時(shí)防止骨壞死的發(fā)生。如何提高外周血循環(huán)中EPCs的數(shù)量及提高損傷處EPCs的濃度，成為最新研究熱點(diǎn)。

SDF-1是造血干細(xì)胞動(dòng)員和歸巢的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞遷移、增殖、動(dòng)員及血管形成等過(guò)程中起重要作用[11～13]。SDF-1通過(guò)調(diào)節(jié)遲現(xiàn)抗原4表達(dá)，介導(dǎo)CD34細(xì)胞的黏附，在CD34細(xì)胞歸巢至骨髓中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并由此影響其在骨髓中的增殖和分化，使干細(xì)胞具有遷移歸巢的特性。研究表明，SDF-1呈濃度依賴(lài)性促進(jìn)EPCs增殖，并且顯著增強(qiáng)EPCs的成血管能力。尹揚(yáng)光等[14]利用密度梯度離心法獲取并誘導(dǎo)小鼠骨髓EPCs，加入不同濃度SDF-1共培養(yǎng)48 h后，采用血清饑餓法和紫杉醇誘導(dǎo)EPCs凋亡，流式細(xì)胞儀和TUNEL法檢測(cè)SDF-1對(duì)EPCs凋亡率的影響，發(fā)現(xiàn)SDF-1可以抑制EPCs凋亡。當(dāng)組織發(fā)生損傷后，SDF-1水平上調(diào)并立即從損傷組織中釋放，形成一定的SDF-1濃度梯度，使干細(xì)胞動(dòng)員并遷移到損傷的組織。De Falco等[15]證實(shí)，在組織缺氧缺血早期，血漿SDF-1水平明顯升高，提示在組織損傷后局部SDF-1升高動(dòng)員及趨化EPCs開(kāi)始修復(fù)受損組織。康慶林等[16]在大鼠骨髓源性EPCs的培養(yǎng)中，加入不同濃度SDF-1刺激，發(fā)現(xiàn)EPCs的遷移能力呈濃度依賴(lài)性增加，濃度越高作用越明顯，由此提示SDF-1能促進(jìn)骨髓源性EPCs遷移。目前，大多數(shù)學(xué)者傾向于EPCs遷移主要是受趨化因子家族及其受體的操控。

目前，中藥調(diào)控對(duì)EPCs的作用研究主要圍繞其數(shù)量、增殖、遷移和黏附功能。本研究采用中藥骨碎補(bǔ)乙醇提取液培養(yǎng)大鼠EPCs，觀(guān)察其增殖情況及細(xì)胞內(nèi)SDF-1 mRNA表達(dá)水平的變化，探討骨碎補(bǔ)對(duì)SDF-1表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步探討骨碎補(bǔ)在促進(jìn)骨愈合過(guò)程中是否具有促進(jìn)新生血管生成作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度骨碎補(bǔ)乙醇提取液對(duì)EPCs均有促進(jìn)增殖和促進(jìn)SDF-1表達(dá)的作用，其中2 mg/mL骨碎補(bǔ)乙醇提取液促進(jìn)大鼠EPCs增殖及加強(qiáng)SDF-1表達(dá)作用最顯著。

綜上所述，骨碎補(bǔ)乙醇提取液可以促進(jìn)EPCs增殖，其機(jī)制可能與上調(diào)SDF-1表達(dá)有關(guān)。這為補(bǔ)腎強(qiáng)骨類(lèi)中藥在促進(jìn)骨愈合過(guò)程中具有促進(jìn)新生血管生成作用提供了理論依據(jù)。

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