氯化鉀溶液對大鼠腦組織缺血再灌注損傷的影響及機制

方衛，李諾，覃斯娜，覃濤，楊葉桂，陳蒙華

(廣西醫科大學附屬第二醫院，南寧530000)

腦缺血持續一段時間后恢復血供，腦細胞可能因為缺血再灌注而遭受更嚴重的損傷，其機制與細胞凋亡的誘發有關[1]。有研究表明，細胞凋亡與細胞內K+濃度具有密切關系。體外實驗發現，在細胞凋亡初期即可觀察到K+外流，而提高細胞培養液的K+濃度能夠減輕、逆轉細胞凋亡[2]。Ca2+作為細胞的第二信使參與腦內的多種代謝活動，發生缺血再灌注損傷時，細胞內的Ca2+急劇上升，超過Ca2+的調控范圍，造成Ca2+超載以及一系列的級聯反應；也有研究[3]表明，使用鈣通道阻滯劑可以減輕細胞凋亡。因此我們推測，提高細胞外K+濃度可能部分通過拮抗Ca2+超載產生了保護作用。為驗證此假說，2017年3～7月，我們借助大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，在大鼠腦組織恢復灌注時給予氯化鉀(KCl)溶液調整血K+濃度，觀察局部腦組織損傷情況，并對Ca2+超載相關指標進行檢測。

1　材料與方法

1.1　動物與試劑

SPF級健康雄性SD大鼠36只，體質量220～280 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。大鼠術前禁食12 h，自由飲水。鈣ATP酶(Ca2+-ATPase)、乳酸脫氫酶(LDH)、鈣調神經磷酸酶(CaN)、Ca2+檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，鈣調蛋白(CAM)檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.2　動物分組

將大鼠隨機分成模型1組、模型2組和假手術組各12只。

1.3　模型制備與干預

模型1組和模型2組腹腔注射10%水合氯醛麻醉，從大鼠胸鎖乳突肌和頸前肌群之間向深部分離，顯露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。使用動脈夾夾住頸總動脈近心端，縫線結扎頸外動脈遠心端。在頸外動脈距離頸總動脈分叉約5 mm處剪口，用線栓由剪口處經頸外動脈進入頸內動脈，剪斷頸外動脈并游離，調整方向避開翼腭動脈的開口處到達大腦中動脈。當線栓進入長度距頸總動脈分叉處15 mm時，緩慢插入線栓，使線栓頭部剛好完全阻閉右側大腦中動脈入口。阻閉120 min后，拔出線栓并移除頸總動脈的血管夾，使缺血部位恢復灌注；同時模型1組由右側頸外靜脈泵入2.8%KCl溶液90 μg/g，模型2組由右側頸外靜脈泵入生理鹽水90 μg/g。假手術組只分離和結扎右側頸外動脈，不使用線栓阻斷大腦中動脈。恢復灌注后監測大鼠生命體征1 h，隨后縫合傷口，將大鼠放回籠內單獨喂養。

1.4　神經功能評價

再灌注24 h后，各組隨機抽取6只大鼠，依照文獻[4]對大鼠進行神經功能評分。評分標準：0分為正常，無神經損傷癥狀；1分為不能完全伸展對側前爪；2分為向外側轉圈；3分為向對側傾倒；4分為不能自發行走，意識喪失。

1.5　腦組織病理檢查

采用HE染色法。再灌注24 h后，各組隨機取6只大鼠。用10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦；4%多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，常規脫蠟水化，梯度乙醇浸洗。蘇木精染色，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化，自來水沖洗；伊紅染色，自來水沖洗；逆乙醇梯度脫水，二甲苯再次透明，封片。光學顯微鏡下觀察腦組織病理學變化，并拍照記錄。

1.6　腦組織上清液Ca2+超載相關指標檢測

采用比色法。再灌注24 h后，各組取剩余6只大鼠，麻醉，斷頭，取右側腦皮質部分制成勻漿，離心取上清液。Ca2+-ATPase、LDH、CaN活性檢測以及Ca2+水平測定采用化學比色法，CAM檢測采用ELISA法。

1.7　統計學方法

2　結果

2.1　三組神經功能評分比較

模型1組、模型2組、假手術組的神經功能評分分別為(2.17±0.75)、(3.50±0.55)、(0.83±0.41)分。與假手術組比較，模型2組的神經功能評分高(P<0.05)；與模型2組比較，模型1組的神經功能評分低(P<0.05)。

2.2　三組腦組織病理結果比較

與假手術組比較，模型2組低倍鏡下可見明顯的低密度區，且集中于右側皮質部分，此低密度區域正常細胞數量極少；高倍鏡下可見多數細胞發生變性，壞死，可見染色質的邊集、核固縮，空泡細胞也較多見。與模型2組比較，模型1組低倍鏡下可見右側皮質部分低密度區面積明顯減少，正常細胞數量較模型2組增多；高倍鏡下染色質的邊集，核固縮較模型2組少，壞死細胞、空泡狀細胞也明顯較模型2組減少。

2.3　三組腦組織上清液中Ca2+-ATPase、LDH、CaN活性以及Ca2+、CAM水平比較

與假手術組比較，模型2組的Ca2+-ATPase活性降低，LDH、CAN活性增高，Ca2+和CAM水平增加(P均<0.05)；與模型2組比較，模型1組的Ca2+-ATPase活性增高，而LDH、CaN活性降低，Ca2+和CAM水平降低(P均<0.05)。見表1。

表1　三組腦組織上清液中Ca2+-ATPase、LDH、CaN活性以及Ca2+、CAM水平比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型2組比較，#P<0.05。

3　討論

腦缺血再灌注損傷具有復雜的病理生理過程，其發病機制涉及能量代謝紊亂、興奮性氨基酸毒性、細胞內Ca2+超載、自由基損傷、炎癥反應等多個環節。腦缺血再灌注時腦細胞膜受到多種因子的影響，引起一系列的分子生物學反應，使胞核濃縮，核碎裂，核溶解，細胞發生變性、壞死等表現，而且腦內細胞成片的壞死和凋亡，直接影響到神經功能表現。體外研究[2]表明，細胞內的K+對細胞凋亡具有重要作用，提高細胞培養液中的K+濃度能夠減輕甚至逆轉細胞凋亡。本研究通過對動物MCAO模型恢復再灌注的同時給予KCl溶液，觀察提高血清K+濃度能否對腦組織發揮保護作用，探討K+對大鼠腦組織缺血再灌注損傷的影響。結果顯示，模型1組的神經功能評分低于模型2組，HE染色凋亡細胞較模型2組減少。表明缺血再灌注時提高血K+濃度對腦細胞有一定的保護作用。

Ca2+是神經細胞信息傳遞的重要的第二信使，參與細胞內外的各種生物電活動和信息傳遞，維持生物的代謝功能[5]。細胞內Ca2+超載是腦缺血再灌注損傷機制的共同通路，引起神經元死亡的最后途徑[6]。Ca2+-ATPase是細胞內調節Ca2+穩態的重要酶之一，可以把Ca2+轉移至胞質以外，使得胞質內Ca2+濃度維持在較低水平[7]。當Ca2+-ATPase的活性下降時，不能及時將胞質內多余的Ca2+排出細胞外，而胞質高濃度Ca2+狀態還會使得細胞內的Ca2+庫釋放Ca2+，從而引發Ca2+超載，最終誘發一系列的級聯反應導致細胞凋亡[8～10]。Ranasinghe等[11]研究顯示，使用含K+溶液可提高Ca2+-ATPase mRNA的表達，并且提高Ca2+-ATPase mRNA的表達可以改變與心肌收縮和舒張相關的蛋白質，改善心肌收縮壓和舒張壓，從而對機體產生有益的血流動力學影響。本研究結果顯示，腦缺血再灌注損傷后，腦組織中Ca2+-ATPase活性下降，細胞內Ca2+增加，提示細胞內發生了Ca2+超載；而使用KCl調整血K+濃度后，細胞內的Ca2+-ATPase活性上升，胞質內Ca2+濃度降低。這表明提高再灌注液的血K+濃度可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機制可能與拮抗Ca2+超載有關。

CAM是目前發現的生物體內最重要的Ca2+蛋白受體，是Ca2+的細胞內靶點，CAM的激活需要Ca2+的結合。CAM與Ca2+結合后，通過調節與激酶、磷酸酶等靶蛋白的相互作用，成為Ca2+信號轉導通路的一部分[12]。而CaN是一種受Ca/CAM調節的蛋白酶，與腦內多種神經遞質有關，例如多巴胺、谷氨酸等[13]。有研究[14～16]表明，CaN升高與阿爾茨海默病、精神分裂等腦功能損害的疾病有關。本研究結果顯示，大鼠大腦發生缺血再灌注損傷后，CAM和CaN分別伴隨著胞質內Ca2+濃度升高而升高，提示出現了與Ca2+超載特異性相關的損傷。而灌注時接受KCl干預的大鼠，在24 h后CAM、CaN均明顯下降，表現出調整血K+拮抗Ca2+超載的腦保護作用。另一方面，LDH在腦細胞中廣泛存在，可以調節機體的自動代償性保護機制。腦缺血再灌注損傷發生時，腦組織損傷，釋放LDH，使腦細胞內的LDH活性增高。本研究結果顯示，模型1組的24 h LDH水平降低，表明腦損傷程度減輕。

綜上所述，腦組織缺血再灌注損傷后升高血K+濃度，能夠一定程度地減輕腦缺血再灌注損傷，為臨床采用調整血K+水平治療腦損傷提供了實驗依據。

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