昆明漢族人群VKORC1、CYP2C9基因多態性對華法林穩態劑量的影響及預測劑量模型的建立

肖成，胡瑩，王玉明，徐夢云，李婉瀾，柳杰

(昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明650000)

華法林是臨床常用的香豆素類口服抗凝藥，是治療深靜脈血栓、心房顫動、肺栓塞等血栓性疾病及心臟瓣膜置換術后的一線藥物[1]。華法林因其治療窗窄和患者個體差異等因素導致臨床用藥劑量難以評估。維生素K環氧化物還原酶復合體1(VKORC1)和細胞色素P450(CYP)2C9基因多態性是華法林代謝出現差異的主要因素。通過檢測這兩種基因的多態性，可指導華法林的使用劑量，提高達標率并降低出血風險[2]。國際華法林藥物基因組學聯合會通過大量數據分析，推行了華法林劑量的運算平臺。此平臺通過結合VKORC1和CYP2C9基因信息以及患者臨床資料(包括年齡、性別、體質量、種族、聯合用藥等)計算出華法林的個體化劑量，提高抗凝效果的同時大大降低了出血事件的發生。但該平臺的數學模型是根據西方人群的特征建立的，是否適合中國人群還需研究。本研究通過分析VKORC1、CYP2C9基因多態性對華法林穩態劑量的影響，建立適合昆明地區漢族人群華法林預測劑量的數學模型，指導血栓性疾病患者的個體化用藥。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

選擇昆明醫科大學第二附屬醫院2015年10月～2017年2月使用華法林治療的下肢深靜脈血栓患者162例，其中男96例、女66例，年齡(57.26±14.17)歲，身高(164.22±8.20)cm，體質量(64.09±12.59)kg，BMI(23.71±4.03)kg/m2。另外選取臨床資料相匹配的下肢深靜脈血栓患者20例，用于華法林預測劑量模型的驗證。納入標準：規律服用華法林片，且3次隨訪國際化標準比值(INR)范圍在1.7～3.0的昆明籍漢族成年患者。排除標準：嚴重肝腎功能不全、甲狀腺功能異常、腫瘤、結締組織疾病、心力衰竭患者及妊娠婦女，同時服用與華法林藥效動力學及藥物動力學相互影響的藥物者[3]。本研究經醫院倫理委員會批準，獲得患者知情同意。

1.2　VKORC1、CYP2C9基因多態性檢測

采集患者服用華法林后12 h空腹靜脈血3 mL，使用血液基因組DNA提取試劑盒(DP318，北京天根生化公司)提取DNA，采用熒光PCR法和PCR-熒光探針法檢測等位基因位點，使用VKORC1基因檢測試劑盒和CYP2C9基因檢測試劑盒(北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司)檢測VKORC1、CYP2C9基因型。采用25 μL的擴增阻滯突變體系-聚合酶鏈式反應技術(ARMS-PCR)反應體系。12.5 μL PCR反應液，6.5 μL引物探針混合液，4 μL超純水，2 μL基因組DNA。擴增程序：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸35 s，共40個循環，用以檢測等位基因位點。

1.3　華法林個體化預測劑量模型的建立及評價

收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、身高、體質量、BMI、INR、華法林穩態劑量、VKORC1和CYP2C9基因型，采用Pearson相關分析法篩選華法林穩態劑量的相關因素；綜合華法林穩態劑量的相關因素進行多元逐步回歸分析，得到預測劑量模型。對162例患者進行6個月的隨訪。對20例驗證人群給予華法林預測劑量模型所推薦劑量，觀察用藥后出血性事件的發生情況，其評判依據出血學術研究會(BARC)[4]制定的標準。

1.4　統計學方法

2　結果

2.1　CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測結果

CYP2C9基因有151例野生型純合子AA型(93.21%),11例雜合子AC型(6.79%)，無突變CC型。VKORC1基因有138例野生型純合子AA型(85.19%),22例雜合子AG型(13.46%),2例純合子GG型(1.35%)。VKORC1、CYP2C9基因型組合可獲得6種組合：128例AA/AA、21例AA/AG、2例AA/GG、10例AC/AA、1例AC/AG、0例CC/GG。各組合符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律的分布頻率(P>0.05)[5]。

2.2　CYP2C9和VKORC1不同基因型患者的華法林穩態劑量比較

CYP2C9 AA、AC型華法林穩態劑量分別為(2.97±0.65)、(2.51±0.72)mg，AC型華法林穩態劑量低于AA型(P<0.05)；VKORC1 AA、AG、GG型華法林穩態劑量分別為(2.81±0.58)、(3.68±0.67)、(3.40±1.03)mg，AA型華法林穩態劑量低于AG型和GG型(P均<0.05)。

2.3　華法林預測劑量模型建立情況

通過Pearson相關性分析后顯示，華法林穩態劑量與VKORC1和CYP2C9、體質量、年齡相關(r分別為0.398、-0.172、0.211、-0.558，P均<0.05)；與身高、BMI、INR無明顯相關(P均>0.05)。對患者年齡、體質量、VKORC1和CYP2C9基因型進行穩態劑量的多元線性回歸分析，結果顯示，年齡、體質量及VKORC1和CYP2C9基因型是華法林穩態劑量的影響因素(P<0.05或<0.01)。見表1。采用華法林穩態劑量結合對VKORC1、CYP2C9、年齡和體質量進行多元回歸分析，得到最佳預測劑量模型：華法林用量=3.401-0.027×A+0.015×W-0.312×CYP2C9+0.979×(VKORC1-X1)+0.64×(VKORC1-X2)。對于CYP2C9，AA型輸入0，AC型輸入1。對于VKORC1，AA型在(VKORC1-X1)和(VKORC1-X2)均輸入0；AG型在(VKORC1-X1)輸入1，(VKORC1-X2)輸入0；GG型在(VKORC1-X1)輸入0，(VKORC1-X2)輸入1。采用非參數Spearman相關分析法對華法林預測劑量與穩態劑量分析后得出二者具有相關性(r=0.816，P<0.01)。

表1　　　　下肢深靜脈血栓患者華法林穩態劑量相關因素的多元線性回歸分析結果

2.4　華法林預測劑量模型應用評價結果

162例患者隨訪期間均無重大出血事件發生。出現輕度出血事件18例，其中表皮黏膜出血17例、便血1例。18例患者的基因型分別為AA/AA型13例、AC/AG型3例、AC/GG型2例，各型出血事件的發生率分別為9.42%、27.27%、18.18%。使用預測劑量模型推薦華法林用量的20例患者隨訪期間無出血事件發生。

3　討論

華法林作為一種香豆素抗凝劑在臨床上廣泛應用。華法林有S和R兩種對映體。其中S型抗凝活性比R型高3～5倍[6]，其代謝分別由CYP2C9和CYP1A2同工酶催化。CYP家族中CYP2C9基因的多態性影響華法林的使用劑量[7]。CYP2C9是CYP第7號外顯子的第359位氨基酸，若1075位的A堿基替換為C堿基(1075A>C)，則會導致亮氨酸突變為異亮氨酸[8]，這種替換會降低CYP2C9的活性，從而延遲華法林的清除速率及代謝，進一步延長華法林的療效、減少其維持劑量。VKORC1基因多態性將影響維生素K氫醌狀態的維持，此過程可影響維生素K依賴性凝血因子凝血Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的γ-羧化[7]。VKORC1基因突變則會導致對華法林的抵抗[9]。

隨著藥理學結合分子生物學的發展，研究人員通過對患者進行基因檢測并結合患者臨床資料建立符合當地人群的華法林個體化給藥模型。國內外此類模型的建立可以為華法林的用藥提供幫助。有研究報道稱性別、年齡、體質量、INR等非遺傳因素可以解釋12.6%的華法林劑量差異，而CYP2C9和VKORC1的基因多態性等遺傳性因素，可解釋33%～60%的華法林劑量差異[10]。

本研究綜合分析經華法林治療的162例患者的資料，結果顯示華法林穩態劑量與VKORC1和CYP2C9、體質量、年齡相關，與身高、BMI、INR無關。另外選取的20例患者作為驗證人群，對所建立的華法林預測劑量模型進行隨訪驗證，結果證實該模型具有有效性。因此，可結合患者的臨床特征運用本研究所建立的預測劑量模型進行實驗性給藥。本研究對入選的162例患者進行VKORC1和CYP2C9基因檢測，結果顯示VKORC1和CYP2C9基因AA型分布頻率為85.2%和93.2%，與劉俊等[11]報道的結果相似，而CYP2C9基因AC型的分布頻率略高于文獻報道的4.93%。分析其原因為云南漢族人群中混有少數民族基因。VKORC1 AG和GG型的分布頻率為13.6%和1.2%，基本與文獻[12]報道相符。Yuan等[13]研究發現，VKORC1 AG和GG型的VKORC1 mRNA表達水平高于AA型。這會引起VKORC1活性增高，導致產生更多的凝血因子，增加華法林的用量。本研究也驗證了上述發現，VKORC1 AG和GG型的穩態劑量均高于AA型。經過6個月的隨訪，發現18例患者發生了較輕微的出血事件。其中AA/AA型13例、AC/AG型3例、AC/GG型2例。AC/AG型和AC/GG型患者使用華法林穩態劑量后發生的出血事件的比例較多，可能與本研究這兩組基因型的樣本量較少有關，后續可擴大樣本量行進一步的研究。

本研究存在諸多不足之處。研究認為女性患者體內的雌激素作用會導致藥物代謝的個體差異性顯著大于男性[14]。本研究未對男女患者分別統計其華法林的使用情況。種族差異也會導致基因分布頻率的不同，本研究在入選病例時未咨詢雙親中是否有一方為少數民族。遺傳因素會影響老年患者應用華法林的效果[10]，本研究未對年齡進一步分層，可進一步擴大樣本分別分析不同年齡段各種因素對華法林用藥的影響。其他基因多態性也會影響華法林的使用劑量，如CYP4F2基因、γ-谷氨酰基羧化酶、載脂蛋白E、微粒體環氧化物水解酶編碼基因等[15]，本研究未考慮此類基因的影響。另外，還需對患者是否吸煙、飲酒及高血壓史進行綜合分析。

分子生物學檢測結合預測模型公式用于計算華法林的用量在臨床上的應用仍存在諸多爭議。華法林作為藥物基因組學研究的熱門藥物雖廣泛應用于臨床，但其臨床研究并不多，而且大多數為國外研究，我國則多為維持劑量的回顧性分析。針對黃種人或漢族人群的負荷劑量、維持劑量的基因型與劑量運算模型的研究相對較少且缺乏驗證。本研究所建立的華法林個體化預測劑量模型可為昆明地區漢族人群提供較為準確的指導，未來仍需擴大樣本量并結合更多相關因素進行綜合研究，以保證華法林用藥的精準和有效。

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