Sphk1在舌鱗狀細胞癌組織中的表達及其對舌癌細胞生物學行為的影響

張惠敏，吳德報，向旭，楊立，沈軍

(1天津醫科大學，天津300000；2天津市口腔醫院)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)在口腔癌中所占比例高達90%[1]，其中又以舌鱗狀細胞癌(TSCC)最常見。TSCC惡性度高、侵襲性強，患者預后差，5年生存率僅50%左右[2]。因此，迫切需要尋找新的高效的TSCC診斷與治療分子標記物。鞘氨醇激酶(Sphk)是調節鞘脂代謝的關鍵因子，在人體中有Sphk1和Sphk2兩種亞型，其中Sphk1具有癌基因特性，參與腫瘤形成，在多種腫瘤中過表達，并與患者的預后密切相關[3,4]。目前,關于Sphk1在TSCC發生發展過程中作用的報道較少。2016年5月～2017年4月，我們應用免疫組化法檢測Sphk1在TSCC中的表達，并分析其表達水平與臨床病理特征的關系，同時采用Sphk1抑制劑N，N-二甲基鞘氨醇(DMS)干預舌癌Tca8113P160細胞，觀察其對舌癌細胞增殖、遷移及侵襲能力以及上皮間質轉化(EMT)相關蛋白E-cadherin、N-cadherin表達的影響，探討Sphk1在TSCC發生發展過程中的作用及機制。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

隨機選取2006～2017年于天津市口腔醫院行手術治療的TSCC患者標本50例，口腔白斑病標本28例，同期切取的癌旁正常舌黏膜標本(距原發灶邊緣≥1.5 cm)10例。TSCC患者術前均未行放化療及其他輔助治療，術后均經病理證實。根據UICC(2002)TNM分期標準確定臨床分期，Ⅰ+Ⅱ期18例，Ⅲ+Ⅳ期32例。36例同期行頸淋巴清掃術，其中頸淋巴轉移25例，均未發現遠處器官轉移。

1.2　細胞培養方法

舌癌Tca8113P160細胞由天津市口腔醫院中心實驗室傳代保存。向細胞中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱內傳代培養。收集對數生長期細胞用于實驗。

1.3　TSCC、白斑及正常舌黏膜組織中Sphk1表達檢測

采用免疫組化染色法。將TSCC、白斑及正常舌黏膜石蠟標本切片,經烘片、脫蠟至水后微波熱修復抗原(枸櫞酸抗原修復液)，血清封閉30 min;加入一抗，4 ℃過夜;加二抗，DAB顯色，PBS水洗終止顯色;蘇木素復染，封片，留鏡檢。高倍鏡下，每張切片隨機選取5個視野計陽性細胞數，取均值。根據陽性細胞百分比計分：<25%計1分，26%～50%計2分，51%～74%計3分，>74%計4分；根據細胞染色強度計分：未著色或呈淡黃色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分；兩項計分乘積0～3為低表達，4～8為高表達。以上工作由兩位富有經驗的病理醫師采用雙盲法判定。

1.4　細胞增殖能力觀察

采用CCK-8法。取Tca8113P160細胞懸液，接種于96孔培養板，每組設6個復孔。細胞貼壁生長達孔底60%時，將細胞分為DMS組和對照組，DMS組加入5、10、20、50、100 μmol/L DMS，對照組加入無藥物培養基，分別干預24、48、72 h，結束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h。另設空白對照組，加入培養基和CCK-8溶液，不加入細胞。使用酶標儀于450 nm波長處測定OD值。

1.5　細胞遷移、侵襲能力觀察

采用Transwell實驗。遷移實驗：將Tca8113P160細胞按6×105/孔接種于6孔培養板，將細胞分為DMS組和對照組。以細胞24 h的DMS藥物半抑制濃度(IC50)23.26 μmol/L作為DMS組的干預濃度，對照組加入無藥物培養基。培養24 h后，加入胰酶消化重懸，調整細胞密度為2×105/mL。取200 μL接種于Transwell小室上室，下室加入500 μL含20%胎牛血清的培養基。培養24 h后取出小室，固定、染色，顯微鏡下隨機選取10個視野計細胞數。侵襲實驗：將Matrigel膠用RMPI-1640培養基按1∶8稀釋，鋪于Transwell小室的上室面，其余步驟同遷移實驗。

1.6　細胞中Sphk1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達檢測

采用Western blotting法。細胞接種于培養皿，將細胞分為DMS組和對照組，干預措施同Transwell實驗。提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠電泳，轉PVDF膜；封閉1 h后加入一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜；加二抗，室溫孵育70 min；化學發光法顯色，定影。Image J圖像處理軟件分析灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/同一樣本內參條帶的灰度值。

1.7　統計學方法

2　結果

2.1　TSCC、白斑及正常舌黏膜組織中Sphk1表達比較

Sphk1主要表達于細胞胞質，陽性部位主要呈淡黃色、棕黃色至深褐色。Sphk1在TSCC、白斑及正常舌黏膜組織中的高表達率分別為62.0%、42.9%、0，TSCC組織高于白斑及正常舌黏膜組織(P均<0.01)。

2.2　不同臨床病理特征患者Sphk1表達情況比較

臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移、T3+T4分期、中低分化程度患者的Sphk1高表達比例分別高于臨床分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移、T1+T2分期、高分化程度患者(P均<0.05)；不同性別、年齡、吸煙、飲酒情況患者Sphk1高表達比例比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1　不同臨床病理特征患者Sphk1表達情況比較(例)

2.3　兩組細胞增殖能力比較

DMS組24、48、72 h細胞增殖OD值均低于同期對照組(P均<0.05)。見表2。

表2　兩組細胞OD值比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4　兩組細胞遷移及侵襲能力比較

遷移實驗顯示，DMS組穿膜細胞數為(176.17±19.75)個，對照組為(279.83±23.45)個；侵襲實驗顯示，DMS組穿膜細胞數為(128.00±13.78)個，對照組為(209.67±18.82)個。DMS組穿膜細胞數均較對照組減少(P均<0.01)。

2.5　兩組細胞中Sphk1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達比較

與對照組相比，DMS組Sphk1、N-cadherin蛋白表達減少，E-cadherin蛋白表達增加(P均<0.05)。見表3。

表3　 　　　兩組細胞中Sphk1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

3　討論

研究發現，鞘脂具有信號調節作用，在腫瘤細胞代謝過程中發揮重要作用。目前，研究較多的鞘脂分子主要有神經酰胺(Cer)和鞘氨醇1-磷酸(S1P)。Cer主要抑制細胞增殖、促進細胞凋亡；而S1P與之相反，主要促進細胞增殖、抑制細胞凋亡。Cer與S1P在細胞內相互轉化，并處于動態平衡，二者的平衡狀態決定細胞的存亡，這種平衡狀態被稱為“鞘脂-變阻器”。Sphk1是鞘脂-變阻器的關鍵調控因子，可使Cer轉化為S1P從而促進細胞存活[5]。大量研究表明，Sphk1具有癌基因特性，其活化與一系列腫瘤細胞生物學特性關系密切。過表達Sphk1的NIH3T3纖維組織母細胞在裸鼠中能夠形成腫瘤[6]；轉染MCF-10A正常乳腺上皮細胞使其過表達Sphk1后，細胞的增殖和侵襲能力明顯增強[7]。另外，敲除Sphk1基因可致實驗鼠血液內S1P水平減低，干擾Akt-mTOR信號傳導通路并顯著抑制4-NQO的致癌作用[8]；使用Sphk1抑制劑DMS或Sphk1 shRNA下調Sphk1表達均能顯著抑制結腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力[9]。以上研究表明，Sphk1在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。目前有關TSCC與Sphk1關系的研究較少，Sphk1在TSCC發生發展中的作用及機制尚不清楚。

本研究結果顯示，正常舌黏膜、白斑及TSCC組織中Sphk1的表達依次增強，且其高表達與TSCC患者的臨床分期、淋巴結轉移、T分期及組織學分級相關，說明隨著TSCC惡性程度加劇，Sphk1表達水平升高。Li等[10]檢測了142例鼻咽癌組織中Sphk1表達情況，發現有93例組織中Sphk1高表達，且其表達與腫瘤臨床分期、T分期、淋巴結轉移及遠處轉移和局部復發情況密切相關。Song等[11]發現，Sphk1在非小細胞肺癌原發灶中的表達水平較正常組織明顯升高，且其表達隨著腫瘤臨床分期、T分期的增加和淋巴結轉移而增強。本研究結果與其一致。提示Sphk1與TSCC的發生發展密切相關，其過表達可能導致細胞惡性轉化。

本研究進一步從細胞水平探討Sphk1對TSCC的作用及機制，采用Sphk1特異性抑制劑DMS抑制其表達，檢測其表達下調對Tca8113P160細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。異常增殖是腫瘤細胞惡性生物學行為之一，Sphk1可通過誘導Cer轉化為S1P進而促進腫瘤細胞增殖。本研究結果顯示，Sphk1活性被DMS抑制后，Tca8113P160細胞的增殖能力減弱。Zhao等[12]發現，頭頸癌JHU-22細胞中Sphk1活性被抑制后，細胞內Cer積聚，進一步抑制Bcl-2活化，促進腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖。由此推測，舌癌細胞的增殖能力減弱可能與Sphk1活性被抑制后，細胞內Cer水平增高有關，但具體機制還有待進一步探討。

侵襲及轉移是TSCC細胞的主要特征之一，Sphk1在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發揮重要作用[13]。本研究結果顯示，在遷移及侵襲實驗中，Sphk1表達下調后，穿膜細胞數較對照組均減少，說明下調Sphk1表達后細胞的遷移及侵襲能力受到明顯抑制。另外，EMT在OSCC侵襲及轉移過程中起關鍵性作用。EMT發生的標志是上皮標記物E-cadherin的表達減少或喪失，伴隨N-cadherin、Vimentin等間質標記物的表達上調[14]。Liu等[15]發現，過表達Sphk1的肝癌HepG2細胞可通過自噬溶酶體通路促進E-cadherin降解，增加N-cadherin表達，誘導EMT發生，進而促進細胞遷移及侵襲。諸葛春風等[16]采用DMS抑制結腸癌細胞Sphk1表達，發現Vimentin表達下調，而E-cadherin水平上調，細胞EMT發生逆轉，同時削弱了細胞的遷移能力。由此推測，Sphk1下調介導的遷移、侵襲抑制作用可能與EMT相關。本研究顯示，下調Sphk1表達后，EMT相關蛋白E-cadherin表達升高、N-cadherin表達下降。說明Sphk1下調介導的Tca8113P160細胞遷移及侵襲能力下降與EMT相關。

綜上所述，Sphk1在TSCC組織中呈高表達，其表達下調后細胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到抑制，其介導的細胞遷移和侵襲能力的降低可能與EMT相關。通過進一步探討Sphk1在TSCC發生發展過程中的作用機制，有望為TSCC的診斷與治療提供新的靶點。

參考文獻：

[1] Bagan J, Sarrion G, Jimenez Y. Oral cancer: Clinical features[J]. Oral Oncol, 2010,46(6):414-417.

[2] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013[J]. CA Cancer J Clin, 2013,63(1):11-30.

[3] Pitson SM, Powell JA, Bonder CS. Regulation of sphingosine kinase in hematological malignancies and other cancers[J]. Anti-cancer Agents Med Chem, 2011,11(9):799-809.

[4] Heernan-Stroud LA, Obeid LM. Sphingosine kinase 1 in cancer[J]. Adv Cancer Res, 2013,117:201-235.

[5] 張彩霞,何紅偉,邵榮光.鞘氨醇激酶與腫瘤[J].藥學學報,2013,48(7):971-978.

[6] Xia P, Gamble JR, Wang L, et al. An oncogenic role of sphingosine kinase[J]. Curr Biol, 2000,10(23):1527-1530.

[7] Zheng XD, Zhang Y, Qi XW, et al. Role of Sphk1 in the malignant transformation of breast epithelial cells and breast cancer progression[J]. Indian J Cancer, 2014,51(4):524.

[8] Shirai K, Kaneshiro T, Wada M, et al. A role of sphingosine kinase 1 in head and neck carcinogenesis[J]. Cancer Prev Res, 2011,4(3):454-462.

[9] Liu SQ, Su YJ, Qin MB, et al. Sphingosine kinase 1 promotes tumor progression and confers malignancy phenotypes of colon cancer by regulating the focal adhesion kinase pathway and adhesion molecules[J]. Int J Oncol, 2012,42(2):617-626.

[10] Li W, Tian Z, Qin H, et al. High expression of sphingosine kinase 1 is associated with poor prognosis in nasopharyngeal carcinoma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,460(2):341-347.

[11] Song L, Xiong H, Li J, et al. Sphingosine kinase-1 enhances resistance to apoptosis through activation of PI3K/Akt/NF-κB pathway in human non-small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2011,17(7):1839-1849.

[12] Zhao Y, Ling ZQ, Hao YB, et al. MiR-124 acts as a tumor suppressor by inhibiting the expression of sphingosine kinase 1 and its downstream signaling in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2017,8(15):25005-25020.

[13] Pan J, Tao YF, Zhou Z, et al. An novel role of sphingosine kinase-1 (SPHK1) in the invasion and metastasis of esophageal carcinoma[J]. J Transl Med, 2011,9:157.

[14] 徐香蘭,韓冰,鐘啟平,等.RNA干擾沉默HIF-1α基因對舌癌Tca8113細胞侵襲和遷移的影響[J].山東醫藥,2013,53(43):5-8.

[15] Liu H, Ma Y, He HW, et al. SPHK1 (sphingosine kinase 1) induces epithelial-mesenchymal transition by promoting the autophagy-linked lysosomal degradation of CDH1/E-cadherin in hepatoma cells[J]. Autophagy, 2017,13(5):900-913.

[16] 諸葛春風,劉詩權,譚林,等.Sphk1和FAK對人結腸癌HCT116細胞上皮間質轉化的影響[J].中國病理生理雜志,2016,32(3):439-444.