STAT3信號(hào)通路在人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制探討

施引，朱肖肖，張振，郭強(qiáng)，趙霖，魏然，孫琳琳，尹訓(xùn)強(qiáng)，張?jiān)坪?，姜?guó)勝，李霞

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250200；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)位于人類(lèi)基因組染色體17(17q21.1)上，為STAT蛋白家族成員。STAT3活化后以磷酸化STAT3(p-STAT3)的形式轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)[1]。白血病患者存在樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)功能缺陷，是特異性的腫瘤抗原不能有效激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要因素之一。因此，將白血病細(xì)胞誘導(dǎo)生成DC，白血病來(lái)源DC既具有抗原提呈功能又同時(shí)攜帶白血病腫瘤抗原，可以更加有效地激發(fā)傳統(tǒng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷功能[2]。但是，目前細(xì)胞因子誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向DC分化的方法存在誘導(dǎo)效率不高、體內(nèi)轉(zhuǎn)輸效果不穩(wěn)定等問(wèn)題，且誘導(dǎo)機(jī)制尚不明確[3]。2016年10月～2017年10月，我們通過(guò)建立細(xì)胞因子誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向DC分化模型，探討STAT3信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用，以期進(jìn)一步闡釋白血病來(lái)源DC誘導(dǎo)分化機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和途徑。

1　材料與方法

1.1　材料

人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Biological Industries公司；人重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(rhGM-CSF)、人重組白細(xì)胞介素4(rhIL-4)購(gòu)自美國(guó)R&D公司，脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，M-MLV購(gòu)自美國(guó)Promega公司；抗人DC表面分子流式抗體: FITC-CD11c、PE-CD80、PECy5-HLA-DR 和APC-CCR7均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；內(nèi)參照GAPDH、STAT3、DC分化轉(zhuǎn)錄因子E2-2引物由上海Biosune生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1；STAT3、p-STAT3和GAPDH Western blotting抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

表1　各基因引物序列及產(chǎn)物片段

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

[1].2.1細(xì)胞培養(yǎng)THP-1細(xì)胞采用RPMI1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%雙抗，1%丙酮酸鈉，0.1%巰基乙醇)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

[1].2.2誘導(dǎo)分化模型建立取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105/mL；接種于6孔平底培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組和觀(guān)察組，每組3個(gè)復(fù)孔。觀(guān)察組培養(yǎng)于含25 ng/mL rhGM-CSF和10 ng/mL rhIL-4的RPMI1640完全培養(yǎng)基，隔日半量加液，第5天加入LPS(1 μg/mL)；對(duì)照組培養(yǎng)于RPMI1640完全培養(yǎng)基。第7天分別收集兩組細(xì)胞，用于形態(tài)學(xué)觀(guān)察、流式細(xì)胞術(shù)分析、q-PCR、Western blotting檢測(cè)。

[1].2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察將兩組細(xì)胞分別置于倒置顯微鏡下，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化。

[1].2.4DC表面分子檢測(cè)收集兩組細(xì)胞，1×PBS洗2遍(700 g×5 min)，去上清；1×PBS重懸細(xì)胞至1×106/mL，按照說(shuō)明書(shū)加入FITC-CD11c、PE-CD80、PE-Cy5.5-HLA-DR、APC-CCR7，4 ℃避光孵育30 min；PBS洗2遍，離心去上清；細(xì)胞重懸于100 μL 1×PBS，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)志性分子CD11c及DC表面功能分子(共刺激分子CD80、組織相容性抗原HLA-DR、趨化因子CCR7)。

[1].2.5細(xì)胞STAT3、E2-2 mRNA檢測(cè)采用q-PCR法。收集兩組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度；M-MLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA，UltraSYBR Mixture PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，根據(jù)獲得數(shù)據(jù)計(jì)算2-ΔΔCT值，以此表示STAT3、E2-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

[1].2.6細(xì)胞STAT3、p-STAT3蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。收集兩組細(xì)胞，1×PBS洗兩遍(350 g×4 min)；RIPA裂解液提取總蛋白，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度；加入1/4體積5×loading buffer，100 ℃加熱10 min；12% SDS-PAGE凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜；5% BSA封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h；PBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光儀中曝光成像。Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，形態(tài)均勻；細(xì)胞因子誘導(dǎo)后觀(guān)察組細(xì)胞可見(jiàn)明顯的樹(shù)突狀突起，呈現(xiàn)DC形態(tài)學(xué)變化。見(jiàn)圖1。

注:A為對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)；B為細(xì)胞因子誘導(dǎo)后觀(guān)察組細(xì)胞形態(tài)。

圖1細(xì)胞形態(tài)變化(×200)

2.2　兩組DC表面分子表達(dá)變化比較

與對(duì)照組比較，觀(guān)察組DC表面標(biāo)志性分子CD11c及DC表面功能分子(共刺激分子CD80、組織相容性抗原HLA-DR、趨化因子CCR7)均表達(dá)增加(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　　　　兩組DC表面標(biāo)志性分子CD11c及DC表面功能分子表達(dá)變化比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3　兩組細(xì)胞STAT3、E2-2 mRNA及STAT3蛋白、p-STAT3蛋白表達(dá)變化比較

與對(duì)照組比較，觀(guān)察組細(xì)胞STAT3、E2-2 mRNA及STAT3蛋白、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均增加(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　　　　兩組細(xì)胞STAT3、E2-2 mRNA及STAT3蛋白、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3　討論

STAT蛋白家族是一類(lèi)由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等多肽類(lèi)配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，有7個(gè)成員，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5(a/b)和STAT6[4]。STAT3是STAT家族重要成員之一，活化后形成二聚體，入核調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)。正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中STAT3的激活是快速而短暫的，而STAT3異常表達(dá)及活性狀態(tài)在白血病細(xì)胞增殖失控、分化障礙及凋亡受阻中發(fā)揮了重要作用，參與了白血病的發(fā)生與發(fā)展[5, 6]。STAT3在髓源性DC分化中具有重要作用，髓源性DC分化高度依賴(lài)FMS樣酪氨酸激酶3及其配體(Flt3-Flt3L)信號(hào)通路，STAT3被Flt3-Flt3L相結(jié)合后活化，入核促進(jìn)DC分化特異性核轉(zhuǎn)錄因子E2-2轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)DC分化[7]。但是，STAT3信號(hào)通路在白血病細(xì)胞向DC分化過(guò)程中的作用尚不清楚。

DC起源于多功能造血干細(xì)胞，是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，目前已知的DC亞群包括存在于淋巴組織、血液和非淋巴組織的經(jīng)典DC(cDC),以及分泌Ⅰ型干擾素的漿細(xì)胞樣DC(pDC),它們?cè)诳鼓[瘤、低抗病原微生物感染及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用[8, 9]。白血病患者DC數(shù)量少、功能低以及伴有發(fā)育及成熟障礙，不能有效激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，殺傷白血病細(xì)胞能力減弱[10]。因此，將白血病細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)生成DC，誘導(dǎo)后的DC含白血病相關(guān)的特異性抗原，能夠直接把白血病抗原呈遞給T細(xì)胞，進(jìn)而殺傷白血病細(xì)胞[11]。但是，目前誘導(dǎo)還存在誘導(dǎo)效率不高，DC功能不穩(wěn)定等不足，因此明確其誘導(dǎo)分化機(jī)制是提高誘導(dǎo)效率與功能的突破口。

E2-2又稱(chēng)轉(zhuǎn)錄因子4(Tcf4)，由Tcf4基因編碼，屬于E蛋白家族成員[12]。E2-2高表達(dá)于具有DC分化潛能的造血干細(xì)胞，通過(guò)結(jié)合靶基因上的調(diào)節(jié)性“E box”序列(CANNTG)促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄[13～15]。E2-2通過(guò)調(diào)節(jié)DC祖細(xì)胞中Tlr7、Tlr9、Irf7及Irf8等DC分化基因促進(jìn)DC發(fā)育分化，是DC分化發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[16]。研究顯示，人和鼠的DC中均高表達(dá)E2-2，E2-2敲除小鼠的DC分化發(fā)育受阻[17]。編碼E2-2的基因近端啟動(dòng)子區(qū)域含有STAT識(shí)別位點(diǎn)，但STAT 如何調(diào)節(jié)DC分化祖細(xì)胞中E2-2表達(dá)目前尚不十分清楚[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在髓系DC分化發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)lt3L活化STAT3，進(jìn)而激活E2-2轉(zhuǎn)錄；活化的E2-2通過(guò)“E box”序列與靶基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合，調(diào)控一系列與DC分化發(fā)育相關(guān)的靶基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)髓系DC分化發(fā)育[18]。在細(xì)胞因子誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向DC分化過(guò)程中，是否也存在STAT信號(hào)通路促進(jìn)的E2-2轉(zhuǎn)錄尚未見(jiàn)報(bào)道。此方向的深入探索有望進(jìn)一步闡釋STAT信號(hào)通路在DC誘導(dǎo)分化中的作用，成為新的有效干預(yù)靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，在GM-CSF聯(lián)合IL-4誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向DC分化體系中，存在明顯STAT3蛋白表達(dá)上調(diào)及活化，同時(shí)伴隨E2-2轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，提示STAT3信號(hào)通路活化DC分化發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子E2-2可能是細(xì)胞因子誘導(dǎo)白血病細(xì)胞THP-1向DC分化的重要機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)利用GM-CSF聯(lián)合IL-4誘導(dǎo)白血病細(xì)胞THP-1向DC分化,探討觀(guān)察STAT3信號(hào)通路在此誘導(dǎo)分化模型中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，GM-CSF聯(lián)合IL-4誘導(dǎo)后，THP-1細(xì)胞呈現(xiàn)明顯樹(shù)突狀改變，細(xì)胞表面DC標(biāo)志性分子CD11c及DC功能性分子CD80、HLA-DR、CCR7表達(dá)增加，提示THP-1細(xì)胞在細(xì)胞因子作用下向DC分化。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，STAT3總蛋白表達(dá)及磷酸化水平均升高，提示STAT3信號(hào)通路活化在細(xì)胞因子誘導(dǎo)THP-1向DC分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。另外，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子誘導(dǎo)THP-1向DC分化過(guò)程中，E2-2轉(zhuǎn)錄水平升高。提示細(xì)胞因子誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向DC分化過(guò)程中，STAT3信號(hào)通路活化DC分化特異性核轉(zhuǎn)錄因子E2-2，進(jìn)而誘導(dǎo)THP1-1來(lái)源DC分化，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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