姜黃素對大鼠脊髓損傷后神經元GAP—43表達變化的影響

王笑音

【摘要】 目的：探討姜黃素對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后神經元神經生長蛋白43（growth associated protein，GAP-43）表達的影響。方法：制作SCI模型，分為假手術組、生理鹽水治療組、姜黃素治療組，每組25只。用免疫組織化學染色檢測神經元GAP-43的表達變化，檢測動物術后BBB運動評分和斜板實驗。結果：姜黃素治療組較生理鹽水治療組，GAP-43含量較多，差異有統計學意義（P<0.05）；姜黃素治療組的BBB運動評分和斜板實驗明顯優于生理鹽水治療組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：姜黃素能夠改善SCI區域的微環境，促進神經生長因子表達。

【關鍵詞】 姜黃素； 脊髓損傷； GAP-43

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.5.088 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2018）05-0171-02

姜黃素（Curcumin）是從姜黃、郁金、莪術、石菖蒲等根莖提取的一種黃色酸性植物多酚，具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗凝、抗纖維化及抑制腫瘤生長等多種藥理作用[1-3]。近年來研究發現，姜黃素可以通過抑制鈣超載、抗蛋白質聚積改善神經損傷后的微環境，發揮神經保護作用[4]。這里筆者通過使用姜黃素治療脊髓損傷，觀察神經細胞GAP-43表達和神經功能恢復，探討姜黃素對神經系統的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

1.1.1 動物 選取75只體重250～300 g的SD雌性大鼠，動物隨機分三組，即假手術組、生理鹽水治療組和姜黃素治療組，每組25只。

1.1.2 試劑 姜黃素、GAP-43抗體、生物素化羊抗小鼠IgG、ABC試劑。

1.2 動物模型

脊髓損傷模型：腹腔注射戊巴妥鈉麻醉大鼠，四肢固定在實驗臺上，切開后背正中皮膚，分離皮下組織和肌肉，咬除T9～T10棘突和椎板，露出脊髓組織，用手術刀快速向一側半切斷脊髓，沖洗縫合傷口，注射抗生素預防感染。

姜黃素治療組每天給予腹腔注射姜黃素100 mg/kg，1周后停藥[5]，生理鹽水治療組用0.9%Nacl代替姜黃素，假手術組僅給予抗感染治療。

1.3 取材和切片

術后1、3、7、14、21 d每組各處死5只動物取材。腹腔注射戊巴妥鈉麻醉大鼠，剪開胸腔，將針頭從左心室插入至升主動脈，迅速切開右心房，快速灌注0.9%Nacl 250 ml，待液體清亮立刻灌注4%多聚甲醛300 ml，咬除棘突和椎板，暴露脊髓組織，取損傷區脊髓組織，行石蠟包埋切片。

1.4 免疫組織化學染色

切片滴加GAP-43抗體，放置4 ℃過夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素化羊抗小鼠IgG，4 ℃孵育12 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加ABC試劑，DAB染色，蘇木素復染。

鏡下觀察到黃色神經細胞即為GAP-43陽性細胞，每只動物取5張切片，計數陽性細胞總數，取每個時相5例動物的平均值。

1.5 行為學評價方法

采用斜板試驗、BBB運動評分測試動物肢體運動情況[6-7]。

1.6 統計學處理

利用SPSS行統計學分析。數據以（x±s）表示，采用單因素方差分析和t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GAP-43表達

在術后7、14、21 d姜黃素治療組GAP-43表達水平高于生理鹽治療組，差異有統計學意義（P<0.01）。在術后1、3、7、14、21 d生理鹽水治療組GAP-43表達水平均高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 BBB運動評分結果

所有動物術前評分為21分，在術后3 d假手術組評分達到20分，功能基本恢復正常。在術后14 d姜黃素治療組評分明顯高于生理鹽水治療組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 斜板實驗

術前動物斜板實驗角度達70°～75°，術后斜板實驗角度至20°，表明造模成功。術后7、14、21 d姜黃素治療組斜板實驗角度高于生理鹽水治療組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

在脊髓損傷后的早期，適度的星形膠質細胞的膠質化可以通過物理和化學性重建中樞神經系統的整體性，關閉血腦屏障以減少炎癥浸潤，使感染和蔓延的細胞損傷最小化來穩定中樞神經系統的組織；而后轉入繼發性反應期星形膠質細胞由靜止態轉向活化態，并繼續進入增殖態，數目增加、胞體肥大，并遷移到損傷處邊緣，交織成網狀形成膠質瘢痕，成為神經再生的屏障。GAP-43在神經系統發育過程中呈現高水平表達，它可以促進神經細胞生長椎基底部胞漿膜擴張處，對突觸的形成與重建具有重要作用，具有促在神經細胞生長、發育、再生，是神經再生的標志性蛋白[8-10]。鄒明明等[11]采用姜黃素治療損傷的脊髓，發現它可以減少神經膠質酸性蛋白和硫酸軟骨素蛋白多糖的大量表達，減輕了星形膠質細胞的反應性增生，縮小空洞和瘢痕，改善損傷區域的微環境，有利于脊髓斷端軸突再生和殘存神經細胞通過瘢痕區。通過BBB運動評分和斜板實驗發現，姜黃素組和生理鹽水組動物在損傷早期（1～3 d）的肢體運動能力和控制體位能力變化不明顯，但是到了損傷中晚期（7～21 d）動物運動功能恢復情況出現明顯改善，且以姜黃素組變化最為明顯，此外GAP-43的表達水平在術后14～21 d呈現高水平表達。這主要是由于脊髓損傷后早期炎癥介質大量釋放、神經細胞大量凋亡、神經膠質細胞活化程度較低，導致局部微環境惡劣，神經再生修復能力較弱，但到了脊髓損傷后中晚期由于神經膠質細胞被大量激活形成膠質瘢痕，限制了炎癥擴散，改變了損傷區域微環境，有利于細胞存活，但是也阻礙了神經再生修復[12]，而姜黃素不僅能抑制神經膠質細胞活化，阻礙了膠質瘢痕的形成，而且通過抗炎、抑制鈣超載、抑制蛋白質聚積改善損傷區域的內環境，啟動生長相關基因表達，促進神經再生修復。

總之，姜黃素通過抑制神經膠質細胞活化、抗炎、抑制鈣超載、抑制蛋白質聚積，改善脊髓內環境，有利于神經系統功能恢復。

參考文獻

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（收稿日期：2017-08-03）