肛瘺患者外周血清炎癥細胞因子IL-6和IL-17A表達水平及其在發病中的作用

方可欣，林湘濤，華國花，王永杰，竺王玉

（舟山醫院，浙江　舟山　316021，1.細胞分子生物學實驗室；2.肛腸外科）

肛瘺是一種常見病和多發病，為肛周膿腫自行潰破或切開排膿后傷口經久不愈形成，其發生發展與機體的免疫狀態、炎癥細胞和成纖維細胞的增殖分化失衡密切相關。研究表明，IL-6水平與潰瘍性結腸炎的嚴重程度相關[1]，在結腸炎潰瘍患者中IL-17A也明顯增高[2]。本研究通過對肛瘺患者外周血清炎癥細胞因子IL-6、IL-17A進行分析，以期闡述肛瘺患者炎癥細胞因子對其發生發展的影響。

1　對象和方法

1.1對象選取2015年9月至2016年8月間在舟山醫院接受肛瘺手術的患者49例為肛瘺組，年齡19～79歲，平均（46.6±13.2）歲，其中男42例，女7例；肛瘺病例診斷依據2006年中華中醫藥學會肛腸分會、中華醫學會外科學分會結直腸肛門外科學組、中國中西醫結合學會大腸肛門病專業委員會共同制定的《肛瘺臨床診治指南》。入選的肛瘺患者，采血前已排除激素類抗炎藥物和免疫抑制劑的使用，并且排除其他的感染性疾病或嚴重的器質性病變。選擇同期在我院進行體檢的48例健康者作為對照組，其性別、年齡與肛瘺組差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經本院倫理委員會審核批準，所有入組者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器流式細胞儀（FACSCaliburTM，美國BD公司），試劑盒購自美國BD公司，內含人IL-6捕獲微球、人IL-17A捕獲微球、PE檢測試劑、細胞因子標準品凍干粉、流式細胞儀校正微球、PE陽性質控品、FITC陽性質控品等，全自動化學發光儀（UniCel DXI800，美國Beckman Coulter公司），試劑為該儀器配套試劑。

1.3方法

1.3.1標本采集：用含分離膠和促凝劑的真空采血管采集靜脈血3 mL，肛瘺組在術前采集清晨空腹肘靜脈血，對照組于清晨空腹時采集。血清在4 h內3000 r/min離心5 min。糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）檢測采用電化學發光法，另取血清1 mL置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2配制標準品：將凍干的人IL-6、IL-17A標準品，室溫靜置15 min，加入2 mL實驗稀釋液重懸，讓其自然溶解，避免劇烈震蕩，室溫平衡15 min，用移液槍輕輕地吸到流式管中。另準備10根流式管，各加300 μL實驗稀釋液。用槍頭輕微地混勻標準品，依次稀釋1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶216、1∶512、0∶1。

1.3.3混合微球：每種微球旋渦振蕩幾秒后，取10 μL/管×測量管數的量，即為每管微球的總量，一共7種微球。充分混合后1500 r/min離心5 min，加入與上清相同體積的血清增強緩沖液，旋渦充分混勻。室溫避光孵育30 min。在所有測試管中加入50 μL PE檢測試劑，50 μL孵育后的捕獲微球混合液。在標準品管中加入稀釋好的標準品，樣本管中每管加入50 μL樣本。將混合后的測試管避光孵育3 h后，用1 mL洗滌液洗滌，1500 r/min離心5 min，小心吸出各檢測管的上清棄去。每管加300 μL洗液，旋渦振蕩重懸細胞。FACSCaliburTM流式細胞儀至少檢測1×105個細胞。所用檢測軟件為CellQuest自動軟件。CBA軟件（美國BD公司）對數據做分析。

1.3.4肛瘺壁病理學檢查：肛瘺病理切片應用HE染色，每個患者有2張或2張以上HE染色病理切片，由2位高年資病理醫師閱片，判定是否符合肛瘺病理學改變。

1.3.5肛瘺膿液細菌培養：將肛管直腸下端黏膜切開后，用無菌棉拭自肛瘺深部取樣，立即送微生物室檢驗。細菌培養嚴格按《全國臨床檢驗操作規程》第3版臨床微生物常規鑒定程序操作，采用Phoenix100或ATB-expression細菌鑒定儀對相應病原菌進行鑒定。

也正是冤家路窄，柳紅驚恐萬狀地竄出玉米地，就瞧見那個偷瓜賊抱著一只大西瓜，篤悠悠地朝玉米地走來，他大概也把這片玉米地當作掩護偷盜的天然屏障了。癩阿小走到玉米地邊上，剛想松口氣的當兒，柳紅突然從玉米地里跳將出，沖他大喝一聲。與其說他是被柳紅嚇倒了，倒不如說是被這種突發性的狀況所嚇倒了；癩阿小見到柳紅就跟見到鬼似的。不由自主地扔下那只大西瓜，轉身就跑。

1.4統計學處理方法采用SPSS17.0和GraphPad Prism5.0統計軟件包進行統計。計量資料為正態分布時，以±s表示，組間比較采用t檢驗；為偏態分布時，以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。相關性分析采用Pearson相關性檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1肛瘺患者外周血清IL-6、IL-17A水平肛瘺組外周血清IL-6水平明顯高于對照組，2組比較差異有統計學意義（P=0.002），但肛瘺組外周血清IL-17A水平與對照組比，差異無統計學意義（P=0.521），見表1。觀察肛瘺患者肛瘺壁的病理現象，發現肛瘺組外周血清IL-6和IL-17A表達水平正常者，肛瘺壁僅少量淋巴細胞浸潤，而對于IL-6和IL-17A表達水平增高者，肛瘺壁則出現大量淋巴細胞浸潤，見圖1。

2.2肛瘺患者外周血清IL-6、IL-17A的相關性及與CA199關系在對照組外周血清中，IL-6與IL-17A及IL-6、IL-17A與CA199間均無明顯的相關性（P=0.234、0.455、0.506），見圖2A-C。對肛瘺組外周血清IL-6、IL-17A水平相關性分析發現，IL-6與IL-17A并不具有明顯的相關性（r=0.262，P=0.069），見圖2D；IL-6與肛瘺組CA199水平具有明顯的相關性（r=0.629，P＜0.001），見圖2E，而CA199與IL-17A則無明顯的相關性（r=0.068，P=0.647），見圖2F。

表1　肛瘺患者與正常體檢者外周血清細胞因子表達水平[M（P25，P75），pg/mL]

圖1　肛瘺患者肛瘺壁病理學表現（HE）

2.3肛瘺組外周血清IL-6、IL-17A與臨床特征的關系在49例肛瘺組患者中，25例存在肛瘺膿液，23例膿液細菌培養陽性，病原菌檢出陽性率為47.9%，共檢出病原菌23株，其中大腸埃希菌為12株（占52.2%），肺炎克雷伯菌肺炎亞種4株（占17.4%），陰溝腸桿菌2株（占8.7%），其余為金黃色葡萄球菌、白假絲酵母、糞腸球菌、產酸克雷伯菌、銅綠假單胞菌各1株（占4.3%）。對肛瘺患者外周清IL-6、IL-17A水平與臨床特征進行分析，結果顯示肛瘺中存在膿液及膿液細菌培養陽性的患者IL-6水平明顯高于肛瘺中無膿液及膿液細菌培養陰性的患者，差異有統計學意義（P=0.008、0.001），見表2。

3　討論

肛瘺是一種難治性疾病，給患者的生活健康帶來非常不利的影響。盡管肛瘺發病機制尚不完全明確，但免疫反應可能是其中一個重要因素。細菌定植于肛周黏膜后，啟動免疫反應，炎性細胞浸潤，炎癥發生，最終導致瘺管生成。評估肛瘺患者的免疫狀態，對判斷疾病進展具有重要的臨床意義。

IL-6可由活化的巨噬細胞、淋巴細胞或其他細胞分泌，通過經典信號或反式信號途徑激活靶因子。經典信號中IL-6與膜表面IL-6受體結合后，與糖蛋白130進一步結合成二聚體，從而激活下游信號通路；反式信號則通過IL-6與游離IL-6受體結合，激活轉錄因子STAT-3，STAT-3繼而誘導抗凋亡基因Bcl-2，激活T細胞抗凋亡，從而導致腸道炎癥的發生[2-3]。多項研究表明，外周血清IL-6在炎癥性腸道疾病中表達增高，并且與疾病活動度密切相關[4-5]。VAN KEMSEKE等[6]研究認為血清IL-6水平增高可作為靜止期克羅恩病復發的預測指標。在肛瘺患者中，本研究結果也提示其血清IL-6水平增高顯著，并且肛瘺中存在膿液或膿液中細菌培養陽性的患者IL-6水平明顯增高。與腸道炎癥相似，IL-6也可作為一個評估指標評估肛瘺的發生發展情況。

研究發現，T細胞中的IL-6信號可促進轉錄因子RAR相關的孤兒受體γt表達，并進一步促進IL-17A水平的增高，參與Th17細胞的分化[7]。多項研究表明IL-17參與潰瘍性結腸炎的發生進展，在感染旋毛蟲的腸易激綜合征患者腸黏膜IL-17A表達亦增高[8-10]。然而，IL-17A在肛瘺患者中表達是否增高并不明確。本研究結果顯示在肛瘺患者中，血清IL-17A表達水平沒有升高，而且相關性分析顯示IL-6與IL-17A也無明顯相關性，與相關研究結果不同[7]，可能是由于個體差異及研究方法的不同造成的。但病理學檢查顯示IL-6與IL-17A水平均增高患者肛瘺壁出現大量淋巴細胞浸潤，IL-6與IL-17A在促進炎癥的發生中可能具有一定的協同作用。

另外，本結果還顯示肛瘺患者外周血清IL-6與CA199具有一定的相關性。CA199為常用的與胃腸道腫瘤相關的腫瘤標志物，在發生腸道腫瘤時CA199呈現一定程度的增高，而IL-6在結腸癌患者中亦有一定程度的增高[11]。研究還發現深層T淋巴細胞和巨噬細胞分泌IL-6，激活STATL-3，并促進結腸癌細胞增殖[12]。因此，外周血清IL-6增高肛瘺患者應密切監視CA199水平。

圖2　肛瘺患者外周血清IL-6、IL-17A、CA199的相關性分析

表2　肛瘺患者外周血清IL-6、IL-17A與臨床特征的關系[M（P25，P75）]

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