FISH技術檢測hTERC基因表達在宮頸病變診治中的意義

陳露露，王毓莉，周清，周凱，朱華，胡燕

（溫州醫科大學附屬第一醫院　婦科，浙江　溫州　325015）

宮頸癌是女性第二大惡性腫瘤，每年新發病例超過150萬，死亡人數超過30萬[1]。近10年來發病率以每年平均約8.7%的速度遞增[2]。宮頸癌是目前唯一病因明確并可以預防的惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是本病的病因[3]，若早發現早治療，宮頸癌的治愈率幾乎可達100%[4]。

人類染色體端粒酶RNA（human telomerase RNA component，hTERC）基因的擴增在宮頸癌的發生發展中起重要作用，宮頸病變向宮頸癌的轉變過程中幾乎都伴有hTERC基因的異常擴增[5-6]。本研究應用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術檢測hTERC基因在宮頸脫落細胞中的表達情況，以期為宮頸癌的篩查、診治及預后評估提供幫助。

1　資料和方法

1.1一般資料回顧性分析2014年12月至2016年10月因宮頸疾病在溫州醫科大學附屬第一醫院宮頸門診行FISH檢查的235例患者的HPV分型、液基細胞學（liquid-based cytology test，LCT）、陰道鏡活檢病理組織學資料。其中61例患者行FISH檢測后選擇宮頸錐切手術治療。患者年齡21～77歲，平均（41.3±11.0）歲，均為已婚或有性生活史女性，非孕期，無自身免疫性疾病及全身其他惡性腫瘤病史，取材前3 d內無性生活、陰道沖洗及用藥史。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2試劑人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司。細胞學檢查試劑及耗材均購自美國TriPath Imaging公司。hTERC基因檢測試劑GLP TERC/CSP3探針、CSP雜交緩沖液購自北京金菩嘉醫療科技有限公司。

1.3方法HPV分型檢測采用流式熒光雜交法。細胞學檢查采用美國BD SurePath液基細胞學制片技術。細胞學診斷采用伯塞斯達系統（the bethesda system，TBS），結果分為：正常范圍（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）、意義不明的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cells of undetermined signification，ASCUS）、鱗狀上皮內病變（squamous intraepithelial lesions，SIL）、低度鱗狀上皮內病變（low grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、高度鱗狀上皮內病變（high grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）、鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）、不典型腺上皮細胞（atypical glandular cells，AGC）、原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）、腺癌（adenocarcinoma，ACA）。細胞學陽性診斷包括ASCUS及以上病變。陰道鏡檢查由專業的婦產科醫師操作。細胞學及組織病理學結果由2名專業病理科醫師盲法判讀結果。病理結果參照2013年美國陰道鏡檢查與宮頸病理學會（American Society for Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）標準進行診斷。hTERC基因檢測采用FISH技術，參照國內外研究[6-9]，確立FISH閾值為5%，如hTERC基因擴增率大于5%，即FISH檢測結果陽性，提示hTERC基因異常擴增，當擴增率為5%時加大觀測樣本細胞數目，以判斷最后結果。FISH結果由2名專業實驗室技術人員盲法判讀結果。

1.4統計學處理方法采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析。細胞學類型和組織病理學級別與hTERC基因擴增率的關系行Kruskal-Wallis秩和檢驗。細胞學類型和組織病理學級別與FISH檢測結果的關系行趨勢χ2檢驗，當出現任意一個格子理論頻數小于5時采用Fisher確切概率法校正。FISH檢測結果和宮頸術后病理升級情況的比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1細胞學類型與hTERC基因表達情況分析細胞學類型與hTERC基因擴增率行Kruskal-Wallis秩和檢驗，結果顯示組間差異有統計學意義（P=0.001），細胞學類型與FISH檢測結果關系經趨勢χ2檢驗，結果顯示組間差異有統計學意義（P=0.003），由表1可看出隨細胞學病變程度增加，hTERC基因異常擴增率呈上升趨勢。

2.2陰道鏡病理與hTERC基因表達情況分析組織病理學級別與hTERC基因擴增率行Kruskal-Wal-lis秩和檢驗，結果顯示組間差異有統計學意義（P=0.001），組織病理學級別與FISH檢測結果關系經趨勢χ2檢驗，結果顯示組間差異有統計學意義（P＜0.001）。由表2可看出，隨組織病理級別的上升，hTERC基因擴增率和異常擴增率均呈上升趨勢。

表1　細胞學類型和hTERC基因表達的關系

2.3hTERC基因表達與術后病理升級情況分析行FISH檢測后共63例患者選擇行手術治療，其中2例FISH檢測陽性患者的術前病理為宮頸腺癌，已為病理最高級別且該患者選擇手術方式均為宮頸癌根治術，無法評定術后病理升級情況，故未納入，對其余61例行宮頸錐形切除的患者分析其術后病理升級情況。61例患者FISH檢測結果及其相應病理級別的分布情況詳見表3。

表2　陰道鏡組織病理學類型和hTERC基因表達情況

表3　FISH檢測結果及其相應術前陰道鏡病理級別分布情況（n）

FISH檢測結果與術后病理升級情況的關系行χ2檢驗，結果顯示組間差異有統計學意義（P＜0.05），由表4看出hTERC基因異常擴增患者術后病理升級率明顯高于hTERC未異常擴增患者。

表4　FISH檢測結果和術后病理升級情況分布[ n（%）]

3　討論

hTERC基因是端粒酶的重要組成部分，定位于人染色體3q26.3，長度450 bp，是合成端粒重復系列的模板，編碼的蛋白質相對分子質量為380 kDa[10]，該蛋白可以維持端粒長度、調節端粒酶活性，如該基因擴增可阻止細胞凋亡，導致細胞的永生化和腫瘤的發生[11]。2003年，HESELMEYER-HADDAD等[9]首次研究57例LCT標本中的hTERC基因擴增情況，發現63%的宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neopla-sia，CIN）I樣本出現hTERC基因擴增，76%的CIN I I I樣本出現hTERC基因擴增，認為hTERC基因的擴增率隨細胞學病變的加重而增多，可作為宮頸癌篩查的指標。2008年CARAWAY等[12]研究發現在高級別CIN/SCC組hTERC基因擴增率明顯高于NILM/ASCUS組。明蕾等[13]發現在正常組、炎癥或伴濕疣組、CIN I組、CIN I I組、CIN I I I組及宮頸鱗癌組中hTERC基因陽性表達率分別為1.7%、2.6%、55.6%、87.5%、100%和100%。本研究表明，hTERC基因擴增率在宮頸病變不同級別組中存在差異，隨著宮頸病變程度的加重，hTERC基因擴增率和異常擴增率均呈上升趨勢，與上述研究一致。

本研究通過觀察61例行宮頸錐切手術治療患者hTERC基因表達情況與術后病理升級的情況，發現hTERC基因異常擴增患者術后病理級別升級的可能性更大。因此在宮頸病變的早期階段檢測hTERC基因擴增率對預測疾病的轉歸具有一定的作用，FISH陽性患者需引起重視，必要時行診斷性宮頸錐切手術。

目前臨床通用的宮頸癌篩查三階梯式診斷流程為：細胞學和（或）HPV異常則進一步行陰道鏡檢查和（或）宮頸病理組織學活檢。宮頸脫落細胞學檢查聯合HPV檢測是宮頸癌篩查的主要手段，但脫落細胞學篩查敏感性低，存在不明意義涂片結果較多、檢測結果受觀察者主觀影響等問題，難以作出客觀、確切的診斷[4]。HPV檢測敏感性高但特異度較低，可檢出當時HPV感染狀態，但大多數性生活活躍的年輕婦女，HPV感染在一段時間內可自然轉陰，導致HPV陽性的預測意義較低[14]。陰道鏡下CIN的檢出率與很多因素有關，包括操作者熟練程度、檢查指征、活檢區域等，且該檢查為有創檢查，存在出血、感染等風險，導致部分患者拒絕行該項檢查。部分CIN患者存在因宮頸病灶本身微小、可被陰道活檢完全去除的可能，對宮頸術后存在病理陰性的診斷產生影響[15]，提示陰道鏡作為宮頸癌篩查的方法尚存在一些不足之處。因此，需探求更特異的生物學標記來輔助宮頸疾病的早期診斷。

FISH技術已被廣泛應用于基因定位、細胞遺傳學等領域，具有較高的敏感性及特異性。目前國內外均有報道關于應用FISH技術檢測hTERC基因在宮頸疾病的表達情況，但hTERC基因的表達情況與宮頸疾病轉歸關系的前瞻性研究報道并不多。本研究應用FISH技術檢測hTERC基因在宮頸病變中的表達情況，為hTERC基因在宮頸疾病中的診治及預測價值提供了依據。

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