基因沉默整合素連接激酶對滋養細胞生物學功能的影響

林燕燕，廖婷婷，金佳希，陳佳佳，黃賢蘋，項慧秋，董克，許張曄

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院　婦產科，浙江　溫州　325027）

胎盤是維持胎兒生長和發育的重要器官[1-2]。滋養細胞的侵襲缺陷、胎盤淺著床等是子癇前期發病的主要原因[3-4]。任何干擾人類絨毛外滋養細胞增殖、遷移和浸潤的因素都可能導致妊娠相關疾病的發生。整合素連接激酶（integrin linked kinase，ILK）是高度保守的大小為59 kDa的絲/蘇氨酸激酶，在細胞外環境信號轉導黏附細胞的各種生物關鍵調節過程中被發現[5-6]。本研究探討ILK對人滋養層細胞遷移和侵襲過程的影響，并探討其機制，為胎盤相關疾病的研究提供依據。

1　材料和方法

1.1材料TEV-1細胞株由中國香港大學TSAO教授惠贈。胎牛血清和DMEM/F-12培養基購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑TRIzol購自上海普飛公司；PCR反應引物，ILK的siRNA序列均由上海吉凱有限公司設計合成；酶標儀購自瑞士Tecan公司；蛋白抽提、定量、凝膠配制試劑盒和ECL化學發光試劑盒購自上海鼎國生物技術有限公司；Transwell試劑盒購自美國Corning公司；MTS試劑盒購自美國Promega公司；GIEMSA染色液購自美國Sigma公司；ILK、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK3β）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloprotease 9，MMP-9）和GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1TEV-1細胞培養：用含10%熱滅活的FBS、25 mmol/L HEPES、100 U/mL青霉素G和100 U/mL鏈霉素的DMEM/F-12培養基，于37 ℃、含5% CO2的細胞培養箱中常規培養，每2 d更換培養液，待細胞匯聚率達到80%～90%時用胰酶消化傳代。實驗分2組：空白質粒轉染組（NC組）代表的是空白質粒轉染，ILK基因沉默組（KD組）有有效質粒轉染，沉默ILK基因。

1.2.2ILK-siRNA慢病毒構建：由于ILK在人滋養細胞中表達量大，本研究用小干擾RNA靶序列轉染TEV-1細胞，沉默人滋養細胞中的ILK（ILK-siRNA）。ILK的siRNA序列為5’-TTGGTGCCTTCATGTAGTA-3’。滋養細胞接種于6孔板，用不含抗生素的培養液培養過夜，然后用脂質體介導siRNA轉染ILK 2000。轉染48 h后，細胞在無血清培養基中收獲，在引物過濾裝置過濾并濃縮。

1.2.3qRT-PCR：按照Trizol試劑說明書提取總RNA后，依照Tiangen試劑盒說明進行反轉錄操作，制備相應cDNA。按照Takara說明書操作qRT-PCR擴增，引物序列為：GAPDH上游引物5’-TGACTTCAACAGCG ACACCCA-3’（sense），下游引物5’-CACCCTGTTGCTGT AGCCAAA-3’（antisense）；ILK上游引物5’-GACGAC ATTTTCACTCAGTGCC-3’（sense），下游引物5’-ACGGT TCATTACATTGATCCGTG-3’（anti-sense）；GSK3β上游引物5’-GCACTGTGTAGCCGTCTG-3’（sense），下游引物5’-GAGGAGGAATAAGGATGGTAGC-3’（antisense）；MMP-9上游引物5’-GCACCACCACAACATC AC-3’（sense），下游引物5’-ACCACAACTCGTCATCGTC-3’（antisense）。反應條件為95 ℃、30 s預變性，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s測定相應溶解曲線。mRNA的相對定量分析F=2-??Ct，測定標準PCR擴增效率。

1.2.4Western blot：常規消化收集細胞，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，50 mg總蛋白上樣，濃縮膠80 mA、20 min；分離膠120 mA、1 h，電泳結束后，取出凝膠，300 mA 恒流電轉約150 min，將蛋白轉移至PVDF上，轉移膜用5%脫脂奶粉室溫封閉l h后，分別加入一抗（抗ILK 1∶1000，抗GSK3β）抗體1∶1000，抗MMP-9抗體1∶1000和抗GAPDH抗體1∶1000），4 ℃反應過夜，TBST漂洗4次，每次8 min，加入二抗，室溫下孵育PVDF膜1.5 h，并用TBST洗膜4次，每次8 min，最后電化學發光顯影。

1.2.5MTT法檢測細胞活力：收集各組細胞，于96孔板接種，邊緣孔用無菌PBS填充，每組設5個復孔，5% CO2、37 ℃細胞培養箱中孵育24、48、72、96和120 h后，每孔加20 μL 5 mg/mL MTT，繼續孵育4 h，每孔沿孔壁加入100 μL DMSO，酶標儀測定490 nm處吸光度值。每個實驗重復3次。

1.2.6Transwell法檢測細胞侵襲能力：用30 μg Matrigel膠預處理Transwell小室，在小室上部加入100 μL細胞懸液，下室內加入600 μL 30% FBS培養基。37 ℃培養箱培養24 h，24 h后取出上室，Giemsa染色液到膜的下表面染色轉移細胞3～5 min后，將小室浸泡沖洗數次，空氣晾干，顯微鏡拍照計數穿過濾過膜的細胞數。

1.2.7細胞劃痕實驗：單層TEV-1細胞培養過夜并用吸管尖端引入劃痕。然后用光學顯微鏡拍攝0、24 h的圖像。細胞遷移率用細胞遷移至初始無細胞區的百分比計算。

1.3統計學處理方法采用SPSS17.0統計學軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1質粒的轉染效率轉染有效質粒后72 h，用熒光顯微鏡進行可視化分析。結果顯示，質粒轉染的細胞可見綠色熒光，超過80%的細胞表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表明轉染成功，見圖1。

圖1　熒光顯微鏡下觀察TEV-1細胞（×100）

2.2基因沉默ILK后ILKmRNA和蛋白表達基因沉默ILK后，RT-PCR檢測TEV-1細胞的ILK基因表達水平，結果顯示KD組TEV-1細胞ILK mRNA水平顯著下降至NC組的70%，2組比較差異有統計學意義（P＜0.001），見圖2A；Western blot分析顯示，基因沉默ILK顯著降低ILK蛋白的表達水平，2組比較差異有統計學意義（P＜0.001），見圖2B。

圖2　ILK-siRNA對TEV-1細胞中ILK基因和蛋白表達的影響

2.3基因沉默ILK后TEV-1細胞增殖MTT比色法檢測，結果顯示在48、72和96 h，KD組與NC組比，TEV-1細胞的增殖能力顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖3　MTT法檢測轉染后各組細胞增殖能力變化

2.4基因沉默ILK后TEV-1細胞侵襲和遷移 Transwell侵襲實驗結果顯示KD組細胞的侵襲能力與NC組細胞相比顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4A。劃痕實驗檢測TEV-1細胞的遷移能力，結果顯示，NC組細胞自發遷移，在8 h占據劃痕區域的31%，24 h占據100%劃痕區域。與NC組相比，KD組在8 h內，ILK細胞的遷移能力顯著下降（P＜0.05），24 h后，劃痕區域未遷移入滋養細胞，見圖4B。

2.5ILK調節滋養細胞MMP-9和GSK3β的水平 qRTPCR檢測TEV-1細胞的MMP-9和p-GSK3β mRNA表達水平，結果顯示KD組TEV-1細胞MMP-9和p-GSK3β mRNA水平與NC組比顯著下降（P＜0.01），見圖5A；Western blot檢測TEV-1細胞的MMP-9和p-GSK3β蛋白表達水平，結果顯示KD組TEV-1細胞MMP-9和p-GSK3β蛋白水平與NC組比顯著下降（P＜0.01），見圖5B。

3　討論

ILK在介導細胞外基質與細胞內過程之間的關系中起著重要作用。它在各種惡性腫瘤中異常表達和激活，影響細胞增殖、分化、遷移、侵襲和血管生成[7-8]。沉默ILK基因抑制腫瘤的遷移和侵襲能力。ILK在子宮內膜異位癥中的表達上調，在位和異位子宮內膜間質細胞侵襲能力增加[9]。ELUSTONDO等[10]研究發現，在整個妊娠過程，人絨毛膜組織裂解物中可檢測到ILK。ILK在ILK-Akt-Snail通路中對BeWo合成和分化發揮新作用。但很少有研究涉及ILK和絨毛外滋養細胞的關系。本研究結果發現沉默ILK基因抑制滋養細胞的侵襲和遷移。這些結果表明，沉默ILK基因可以干擾人絨毛外滋養細胞的增殖、遷移和侵襲，推測ILK參與滋養細胞的生物學行為的調控，與胎兒生長受限或子癇前期發展息息相關，可能與流產、胎兒生長受限或先兆子癇的發病密切相關。

眾所周知，GSK3β和MMP-9是ILK信號通路中的重要調節因子。本研究發現，沉默ILK基因可以顯著抑制靶信號GSK3β、MMP-9的表達，GSK3β、MMP-9的蛋白和mRNA水平都下降。ILK/GSK3β信號通路是調節細胞生長、分化、細胞代謝和腫瘤細胞生存的通路，抑制ILK可以降低下游信號靶蛋白GSK3β的磷酸化。LUO等[12]研究發現ILK通過在絲氨酸9位點磷酸化抑制GSK3β表達并抑制上皮間質轉化。本研究在滋養細胞沉默ILK基因之后得到相似的結果。MATSUI等[13]研究提出，ILK過表達通過控制MMP-9與膀胱癌侵襲相關。ILK過度表達可增加MMP-9的蛋白水平[11]。本研究發現，ILK可上調MMP-9的表達，ILK-siRNA在TEV-1細胞中下調MMP-9 mRNA和蛋白水平，只有通過蛋白水解酶降解細胞外基質的不同組分，滋養細胞才具有侵襲和遷移能力。MMP-9對滋養細胞的侵襲和轉移能力起著至關重要的作用。

圖5　ILK調節TEV-1細胞中的MMP-9和p-GSK3β水平

圖4　基因沉默ILK后抑制TEV-1細胞侵襲和遷移（×200）

本研究表明，沉默ILK基因可以干擾人類絨毛外滋養細胞的增殖、遷移和侵襲能力，ILK通過抑制把信號GSK3β和MMP-9的表達抑制滋養細胞侵襲和遷移的能力。這些發現可能為胎盤相關疾病提供一個潛在的新的治療選擇，為胎盤相關疾病的進一步研究和治療發現提供相關的參考。

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