姜黃素對APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶及海馬炎癥信號通路的影響

韓園，黃晨苗，方錢娟，劉啟星，南克，項芳芳，曹紅，李軍

（溫州醫科大學附屬第二醫院　麻醉科，浙江　溫州　325027）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種慢性進行性中樞神經系統退行性病變，其主要病理特征是腦內β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）和tau蛋白異常積聚。目前認為AD是免疫激活的炎癥反應過程，神經炎癥是疾病慢性進展的原因并加速病理進程[1]。臨床研究發現AD患者腦中高遷移率族蛋白1（high mobility group box protein-1，HMGB1）水平升高[2]。胞外HMGB1可被細胞表面多種受體所識別，如晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）、Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）等，繼而激活下游核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）炎癥信號轉導通路[3]。姜黃素（curcumin）是植物姜黃中提取的一種可食性多酚類，具抗炎、抗氧化等作用，已證實姜黃素對AD動物模型及細胞模型具有確切的治療效果[4]，但其具體機制尚不明確。本研究擬探討喂飼姜黃素對淀粉樣前體蛋白/早老素1（amyloid precursor protein/presenilin 1，APP/PS1）雙轉基因小鼠學習記憶和海馬Aβ含量及HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB表達的影響，為明確其機制提供參考。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組：20只雄性APP/PS1雙轉基因型小鼠[B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/NJU]和10只雄性同窩野生型小鼠購買于南京大學模式動物研究所，轉基因小鼠隨機分為模型組（M組，n=10）和治療組（T組，n=10），同窩野生型小鼠作為對照組（C組，n=10）。T組4月齡開始喂飼含有姜黃素（100 mg·kg-1·d-1）的飼料直至9月齡，M組和C組喂飼普通飼料。動物飼養于溫州醫科大學實驗動物中心SPF級動物房，室溫保持在（22±2）℃，濕度保持在40%～60%，晝夜交替時間12 h/12 h（9：00-21：00），動物自由飲水和進食。

1.1.2試劑及主要儀器：姜黃素（81025）購自美國Cayman公司；BCA蛋白定量分析試劑盒（MK164230）購自美國Pierce公司；兔抗Aβ1-42抗體（ab10148）、兔抗RAGE抗體（ab3611）和鼠抗TLR4抗體（ab22048）購自英國Abcam公司；兔抗HMGB1抗體（6893）和兔抗NF-κB p65抗體（8242）購自美國CST公司；鼠抗β-actin抗體（ap0060）購自美國Bioworld公司；Morris水迷宮裝置購自北京碩林苑科技有限公司；電泳轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；生物分子成像儀購自美國GE公司。

1.2方法

1.2.1Morris水迷宮實驗：實驗裝置是一個直徑90 cm、高度50 cm的圓形水池，由等分的4個入水點分為4個象限，平臺（直徑4.5 cm）位于第4象限中央，隱藏于水面下1 cm，水池中填充以顏料混勻的不透明白色液體，池內水溫控制在（22±1）℃。水迷宮分為定向航行實驗和空間探索實驗，定向航行實驗共進行4 d，每天訓練4次，每次間隔30 min，每次隨機從4個入水點將小鼠面朝池壁輕輕放入水中，通過水池上方攝像鏡頭經影像跟蹤系統與計算機相連，SLY-WMS Morris水迷宮分析系統記錄實驗過程中小鼠的游泳軌跡，并記錄逃避潛伏期（即找到隱藏平臺所需的時間），小鼠找到隱藏平臺后允許其在平臺上停留15 s，60 s內未找到平臺者，逃避潛伏期記錄為60 s，并將其引至平臺，允許停留15 s。最后一次定向航行實驗結束24 h后進行空間探索實驗，將平臺撤去，限定小鼠60 s的自由游泳時間，記錄其跨越原平臺的次數。

1.2.2免疫組織化學：動物完成行為學實驗后水合氯醛進行麻醉，用0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦組織，經4%多聚甲醛固定和蔗糖溶液梯度脫水，OCT包埋腦組織。切片，片厚20 μm，切片置于PBS洗滌，3% H2O2封閉過氧化物酶體，PBS洗滌，0.01 mol/L枸椽酸緩沖液修復抗原，PBS洗滌，10%山羊血清封閉液中1 h，兔抗Aβ1-42抗體（1∶100）4 ℃孵育過夜，室溫孵育1 h，PBS洗滌，生物素標記的相應抗體（1∶100）室溫孵育2 h，PBS洗滌，過

氧化物酶復合物孵育1 h，PBS洗滌，DAB顯色，PBS洗滌，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯封片。每個腦組織取6張切片，觀察100倍鏡及200倍鏡下海馬組織CA1區和DG區，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算每張切片Aβ數量和IOD值。

1.2.3Western blot：動物麻醉后斷頭取腦組織并分離海馬，保存于液氮中。海馬組織置于研磨管中，加入高強度裂解液和蛋白酶抑制劑進行充分研磨，將勻漿液收集后進行超聲裂解，高速離心后取上清液保存于-80 ℃，采用BCA法測定上清液中蛋白濃度。樣品在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上電泳后，轉膜至PVDF膜，10%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入兔抗HMGB1（1∶1000）、兔抗RAGE（1∶500）、鼠抗TLR4（1∶500）、兔抗NF-κB p65（1∶500）和鼠抗β-actin（1∶5000）抗體，4 ℃搖床孵育過夜，TBST漂洗，再分別與相應的辣根過氧化物酶標記的抗體室溫下孵育2 h，TBST漂洗，均勻涂抹化學發光底物試劑進行曝光顯影，Quantity One（BIO-RAD）軟件分析目的蛋白、內參蛋白的平均光密度值，用作半定量比值測定分析。

1.3統計學處理方法采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析。正態分布計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，非正態分布計量資料以M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。水迷宮定向航行實驗中各組間和訓練天數間比較采用重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1水迷宮實驗結果的比較定向航行實驗中，各組小鼠在水迷宮中的平均逃避潛伏期均隨著訓練天數而逐漸縮短（P＜0.05），各組小鼠間的平均逃避潛伏期差異有統計學意義（P＜0.05）。與C組比，M組的逃避潛伏期延長（P＜0.05），與M組比，T組的逃避潛伏期縮短（P＜0.05），見表1。空間探索實驗中，與C組比，M組的平均跨平臺次數減少（P＜0.05）；與M組比，T組的平均跨平臺次數增多（P＜0.05），見表2。

2.2海馬CA1區和DG區Aβ的比較與C組比，M組小鼠海馬CA1區和DG區Aβ數量及IOD值均明顯增加（P＜0.05）；T組小鼠海馬CA1區和DG區Aβ數量及IOD值較M組均明顯降低（P＜0.05），見表3及圖1。

2.3海馬HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κBp65表達的比較與C組比，M組海馬組織中HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB p65蛋白的表達均上調（P＜0.05）；而與M組比，T組海馬組織中HMGB、RAGE、TLR4、NF-κB p65蛋白的表達均下調（P＜0.05），見表4及圖2。

表1　各組小鼠水迷宮定向航行實驗各天平均逃避潛伏期的比較（n=10，±s，s）

表1　各組小鼠水迷宮定向航行實驗各天平均逃避潛伏期的比較（n=10，±s，s）

與C組比：aP＜0.05；與M組比：bP＜0.05

組別　　第1天　　第2天　　第3天　　第4天C組　51.2±7.8　36.7±11.8　32.6± 7.6　27.2±11.6 M組　58.2±4.2　44.6±14.5　44.8±11.4a　41.9± 7.9a T組　53.5±8.8　36.6± 9.5　33.5±11.7b　33.0± 9.6

表2　各組小鼠水迷宮空間探索實驗平均跨平臺次數的比較[ n=3，M（P25，P75）]

表3　各組小鼠海馬CA1區和DG區Aβ數量及IOD值的比較[ n=3，M（P25，P75）]

3　討論

APP/PS1雙轉基因小鼠表達APP和PS1兩個與早發型AD密切相關的突變基因，APP突變導致腦內Aβ過度產生，而PS1突變加速斑塊的積聚速度[5]。該小鼠4月齡時腦內即出現Aβ斑塊，并在斑塊周圍伴隨小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，而12月齡時在Morris水迷宮中表現出記憶障礙[6]。該轉基因小鼠是研究新型治療策略的一種有效動物模型，尤其在對抗斑塊和相關炎癥的治療中。本研究結果表明，9月齡雄性轉基因小鼠在Morris水迷宮中表現出學習和記憶障礙，海馬中出現Aβ斑塊積聚，且海馬中HMGB1、RAGE、TLR4和NF-κB p65的表達上調，4月齡起口服含姜黃素的飼料改善小鼠在水迷宮中的表現，減少海馬中Aβ斑塊數量，并下調HMGB1、RAGE、TLR4和NF-κB p65的表達。

圖1　各組小鼠海馬CA1區和DG區Aβ斑塊的表達

表4　各組小鼠海馬HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB p65蛋白表達的比較（n=4，±s）

表4　各組小鼠海馬HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB p65蛋白表達的比較（n=4，±s）

與C組比：aP＜0.05；與T組比：bP＜0.05

組別　HMGB1　RAGE　TLR4　NF-κB p65 C組　1.10±0.31　0.94±0.08　0.93±0.13　0.96±0.13 M組　1.51±0.30a　1.10±0.11a　1.13±0.14a　1.25±0.18a T組　1.05±0.36b　0.95±0.13b　0.93±0.13b　0.95±0.18b

圖2　各組小鼠海馬HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB p65的表達

HMGB1作為神經炎癥因子，由損傷的神經元或激活的膠質細胞釋放或分泌，在慢性神經退行性變疾病中HMGB1水平升高[7]，主要分布于淀粉樣斑塊周圍，伴隨小膠質細胞激活，且抑制Aβ42和Aβ40的清除，加速神經元死亡[8]。胞外HMGB1通過與細胞表面不同受體相結合，介導NF-κB信號通路的激活（見圖3），增加炎癥細胞因子的產生，刺激膠質細胞的激活，繼而分泌釋放更多HMGB1，形成正反饋通路，并在多個不同水平維持和放大神經炎性反應[9]。HMGB1引起的的記憶損傷可能是通過TLR4和RAGE共同介導[10]。本研究中，9月齡雄性轉基因小鼠在Morris水迷宮實驗中出現學習和記憶障礙，海馬中HMGB1表達上調，其受體RAGE和TLR4水平也升高，而NF-κB的亞基p65表達也增加。

圖3　HMGB1-RAGE/TLR4-NF-κB p65信號通路圖

姜黃素在預防和治療AD方面具有一定優勢，且不良反應少。姜黃素可抑制Aβ的聚集和低聚化，減少細胞因子和氧化產物的產生，并改善AD動物模型的行為學障礙及癡呆大鼠的學習記憶能力[11-12]，姜黃素還減輕Aβ25-35引起的PC12及BV2細胞的炎癥反應，機制可能涉及調控HMGB1的胞外釋放和表達[13-14]。臨床試驗中，未見姜黃素的臨床相關不良反應，但尚未證實姜黃素能夠改善AD患者的認知功能或相關神經病理過程[15-16]，這可能與選擇的治療時期有關。本研究中，選取4月齡轉基因小鼠開始給予含姜黃素的飼料進行喂養，該時期的小鼠腦中尚未出現相關病理學和相應的行為學改變，口服姜黃素用于早期預防性治療，改善轉基因小鼠的學習和記憶能力，并下調海馬中HMGB1水平，減少其受體RAGE和TLR4的表達，而NF-κB p65表達也減低。

綜上所述，雄性APP/PS1雙轉基因小鼠4月齡起持續5個月喂飼含姜黃素的飼料，能夠改善小鼠的學習記憶能力，機制可能與抑制海馬HMGB1-RAGE/TLR4-NF-κB信號通路相關。

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