HPLC法測定紅羚清散中西紅花苷I和西紅花苷II的含量

★袁娟麗 劉明智 張鈺祺（萍鄉市食品藥品檢驗所 江西　萍鄉　337000）

紅羚清散是萍鄉市中醫院應用多年的純中藥制劑，是依據仲景《傷寒論》六經辨證理論衍化而來，具有平肝祛風，清熱鎮驚，解毒的作用。主要用于熱盛、神昏，譫語發狂，驚癇抽搐，目赤頭痛等癥。紅羚清散主要由羚羊角、西紅花2味中藥組成。目前，紅羚清散的現行質量標準為《江西省食品藥品監督管理局醫療機構制劑》GZJ-0289-（1）-2006，檢驗項目包括“性狀”“鑒別”“檢查”等，暫無含量測定項。為進一步保證該制劑的臨床療效，有效控制其質量，提高其質量標準，本實驗選取紅羚清散中西紅花的主成分西紅花苷I和西紅花苷II為定量指標，采用高效液相色譜法，對其進行含量測定方法的研究。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀（Agilent 1200四元低壓梯度泵系列，Agilent1200化學工作站，DAD檢測器）；西紅花苷I對照品（Stanford Chemicals，批號：PR151116-08，含量以98.52%計），西紅花苷II對照品（Stanford Chemicals，批號：PR160225-17，含量以98.61%計）。水為超純水，甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。實驗用樣品由萍鄉市中醫院提供。

2　方法與結果

2.1色譜條件 Agilent 5 TC-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相：甲醇-水（49∶51），檢測波長為440nm；流速：1.0mL/min；柱溫為35℃；進樣量為10μL。理論板數按西紅花苷I峰計算均應不低于3500。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液的制備 取西紅花苷I對照品、西紅花苷II對照品適量，精密稱定，分別加稀乙醇制成每1mL含20μg和5μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇10mL，稱定重量，冰浴超聲處理（功率500W，頻率40KHz）20min，放冷，稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3方法學考察

2.3.1系統適用性實驗 取對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑，按2.1項下色譜條件測定，比較供試品溶液色譜、混合對照品色譜及空白溶劑色譜，結果供試品中西紅花苷I和西紅花苷II色譜峰有較好的色譜分離，見圖1。

2.3.2線性關系考察 精密稱取西紅花苷I對照品9.93mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為西紅花苷I對照品母液；取母液逐級稀釋成4.8915，9.7830，19.5661，23.4793，39.1321μg/mL的溶液，精密吸取上述對照品溶液及西紅花苷I對照品母液10μL注入液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程為Y=58.91X-4.1531，r=0.9999，結果西紅花苷I在4.8915～195.6607μg/mL之間呈良好線性關系。

另精密稱取西紅花苷II對照品9.82mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為西紅花苷II對照品母液。取母液逐級稀釋成0.9684，1.9367，3.8734，7.7468，19.3670μg/mL的溶液，精密吸取上述對照品溶液及西紅花苷II對照品母液10μL注入液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程為Y=73.687X-3.0682，r=0.99981，結果西紅花苷II在0.9684～193.6700μg/mL之間呈良好線性關系。

圖1　高效液相色譜圖

2.3.3精密度試驗 精密吸取混合對照品（西紅花苷I對照品溶液19.5661μg/mL、西紅花苷II對照品溶液3.8734μg/mL），按2.1項下色譜條件，重復進樣6次，結果西紅花苷I峰面積RSD為1.70%；西紅花苷II峰面積RSD為2.89%。表明精密度良好。

2.3.4重復性試驗 取同批樣品（批號20151106），照2.3項下平行制備供試品溶液6份，照2.1項下色譜條件測定。結果西紅花苷IRSD為2.34%；西紅花苷IIRSD為1.80%，表明此方法的重復性良好。

2.3.5加樣回收試驗 精密稱取已知含量的本品（批號20151106）約0.25g，置具塞錐形瓶中，精密添加混合對照品溶液（西紅花苷I對照品：19.6449μg/mL，西紅花苷II對照品：4.4769μg/mL）10mL，按2.1項下方法試驗，計算回收率，結果見表1-2。

表1　西紅花苷I回收率試驗結果（n=6）

表2　西紅花苷II回收率試驗結果（n=6）

2.3.6穩定性 精密吸取供試品溶液（批號20151106），分別在0、2、4、6、8、12h進樣，按2.1項下色譜條件記錄西紅花苷I和西紅花苷II的峰面積，結果供試品溶液中西紅花苷I和西紅花苷II在12h內峰面積無明顯變化，西紅花苷I RSD為0.79%（n=6），西紅花苷II RSD為0.1.34%（n=6），表明樣品溶液在12h內穩定。

2.3.7樣品測定 取本品5批，照2.1項下方法試驗，測定結果見表3。

表3　樣品測定結果（n=5）　mg/g

3　討論

3.1色譜條件的選擇 參考中國藥典［1］及有關文獻［3］，選擇440nm作為檢測波長，甲醇-水（49∶51）為流動相，在此條件下，各組分的峰型及分離效果良好，同時未見其他成分干擾。

3.2供試品溶液的制備 參考中國藥典［1］，采用超聲提取法，以稀乙醇為提取溶劑。分別對10min、20min、30min提取時間進行比較，結果表明20min已提取完全。同時，因西紅花苷穩定性差，且對溫度非常敏感［10］，分別對供試品在冰浴中和常溫下超聲處理方法進行了對比研究。結果表明，冰浴比常溫提取所測得的西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量略高，故采用冰浴超聲提取作為紅羚清散中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的提取方法。此外，考察了避光條件下與未避光條件下操作，最后確定供試品溶液制備應避光操作，并置于棕色瓶中避光保存。

根據實驗結果可知，不同批次樣品中西紅花苷I與西紅花苷II含量差異顯著，提示西紅花原藥材的質量存在差別，為避免由原藥材引起中成藥的療效差異，有必要對西紅花進行質量控制。本研究建立了同時測定紅羚清散中西紅花苷I與西紅花苷II含量的HPLC方法，經方法學驗證，該方法準確、快速，操作簡便，專屬性強，重現性好，可用于紅羚清散的質量控制。

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