乳液聚合法制備PMMA/CS殼核納微球的研究*

★高淑婷 張媛媛 乾康 萬(wàn)喜 劉偉婷 尹小英（.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌330004；.江西省中醫(yī)藥研究院 南昌　330046；3.上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 上?！?60）

殼聚糖來(lái)源于一種用途廣泛的生物材料甲殼素，這是一種廣泛存在于蟹、蝦殼中的多糖，在自然界有巨大的儲(chǔ)存量［1］。殼聚糖現(xiàn)已廣泛用于開(kāi)發(fā)納米材料，殼聚糖納米粒的研究也成為熱點(diǎn)，如包埋、吸附藥物、核酸、蛋白質(zhì)或者是酶活性方面的應(yīng)用［2-3］。聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是具有無(wú)定型結(jié)構(gòu)的聚合物，具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和良好的硬度［4］。在引發(fā)條件下殼聚糖與PMMA發(fā)生乳液聚合反應(yīng)可在水溶液中形成殼核納米粒，該納米粒兼具良好機(jī)械性和生物相容性。

本實(shí)驗(yàn)在不使用乳化劑條件下，可制備得到PMMA/CS殼核納米微球。在實(shí)驗(yàn)中，我們以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)劑，過(guò)硫酸銨（APS）作為引發(fā)劑，引發(fā)甲基丙烯酸甲酯（MMA）與殼聚糖的接枝共聚反應(yīng)，合成納米微球。研究了乳液聚合過(guò)程中溫度、APS含量、MMA與CS質(zhì)量配比對(duì)殼核納米粒的粒徑的影響并測(cè)定了粒徑分布（PDI）、表面電位（zeta電位），然后通過(guò)三因素三水平正交試驗(yàn)分析了三因素對(duì)乳膠粒接枝率、接枝效率的影響。制備出大小均一，形貌較好，接枝率和接枝效率較高的納米微球。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還考察了納米粒對(duì)藥物的負(fù)載和釋放行為。

1　材料與設(shè)備

1.1試劑 殼聚糖（CS）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）（上海阿拉丁試劑有限公司）；過(guò)硫酸銨（APS）、冰醋酸（西隴化工股份有限公司）；苦參堿（南京普怡股份有限公司）；二次蒸餾水自制。

1.2儀器 DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司）；BS214D型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Malvem納米粒度儀（英國(guó)馬爾文公司）；掃描電鏡（德國(guó)）；透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量12000～14000）；DZF-6020型真空干燥箱（杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1殼聚糖的純化 精密稱(chēng)取10g殼聚糖溶于500mL醋酸溶液（1%v/v）中，過(guò)夜，室溫?cái)嚢钘l件下用10g/L的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH=9析出，過(guò)濾，蒸餾水洗滌沉淀至pH=7，60℃真空干燥備用。

2.2PMMA/CS殼核納米微球的制備 分別精密稱(chēng)取0.3g已純化的殼聚糖，溶于30mL醋酸溶液（1%v/v）中，將溶液轉(zhuǎn)入置于水浴鍋并配備有溫度計(jì)，冷凝管，磁力攪拌器，氮?dú)馊肟诘娜跓恐?。升溫?0℃使殼聚糖充分溶解，通氮?dú)獬テ恐械难鯕夂投趸?。向燒瓶中加入一定量的MMA，通氮?dú)?0min，升溫至一定溫度。將不同量的APS分別添加到混合物中，在一定的溫度下氮?dú)獗Ｗo(hù)攪拌3.5h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，透析48h（透析袋截留相對(duì)分子量為12000～14000），除去未反應(yīng)的MMA單體、MMA均聚物等雜質(zhì)。離心（13000r/min）10min，去除上清液，50℃烘干至恒重。接枝率和接枝效率按下式計(jì)算：

接枝率=（m1-m0）/m0×100%

接枝效率=（m1-m）/m2×100%

式中：m0、m1、m2分別指CS、PMMA/CS微球和加入的MMA的質(zhì)量。

2.3單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 首先分別考慮溫度、MMA與CS的配比，APS的濃度對(duì)PMMA/CS納米微球粒徑的影響并測(cè)定其PDI、Zeta電位，然后根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素與水平，列出正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表1。

表1　因素與水平表

2.4測(cè)試表征 粒徑分析：取適量干燥納米粒粉末，加入適量蒸餾水超聲分散30min成混懸液，采用Malvem公司Zetasizer Nano ZS90型納米粒度與Zeta電位分析儀對(duì)粒度、粒度分布指數(shù)（PDI）、Zeta電位測(cè)定。納米粒形貌表征：滴一滴納米混懸液于載體玻片上，自然晾干后，噴金后用掃描電鏡觀測(cè)其形貌；紅外光譜定性。

2.5溫度對(duì)PMMA/CS納米粒的影響 稱(chēng)取已純化的殼聚糖0.3g溶于1%醋酸30mL，MMA與CS的質(zhì)量配比為2∶1，加入APS的含量為0.009g，反應(yīng)時(shí)間3.5h，固定這些條件不變，按2.2步驟，在不同溫度下反應(yīng)，研究其對(duì)聚合乳膠粒的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　溫度對(duì)納米粒性能的影響

從表中數(shù)據(jù)可知在這4個(gè)溫度下，均有納米粒合成，其中在65℃、70℃、75℃下，溫度對(duì)納米粒的平均粒徑的影響不大，并且粒徑分布較為均勻，納米粒的表面電位也在30mv左右，表明體系較為穩(wěn)定。但在溫度為80℃時(shí)，由于溫度過(guò)高限制了APS與MMA和CS的接枝共聚反應(yīng)引起接枝率低，粒徑較小，干燥后納米粒黏連，導(dǎo)致測(cè)得的粒徑偏離正常值。

2.6MMA/CS配比對(duì)PMMA/CS納米粒的影響 稱(chēng)取已純化的殼聚糖0.3g溶于30mL的1%醋酸，加入APS的含量為0.009g，在70℃反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3.5h，固定這些條件不變，按2.2步驟，僅改變MMA與CS質(zhì)量比，研究其對(duì)聚合乳膠粒的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　MMA/CS配比對(duì)納米粒性能的影響

從表中數(shù)據(jù)可知，納米粒的粒徑在150～250nm之間，并且PDI值都在0.3以下，表明粒徑分布較為均勻，Zeta電位都在30mv左右，體系較為穩(wěn)定。2.7 APS濃度對(duì)PMMA/CS納米粒粒徑的影響 稱(chēng)取已純化的殼聚糖0.3g溶于30mL的1%醋酸，MMA與CS的質(zhì)量配比為2∶1，在70℃反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3.5h，固定這些條件不變，按2.2步驟，改變APS的含量，研究其對(duì)聚合乳膠粒的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　APS濃度對(duì)納米粒性能的影響

2.8正交實(shí)驗(yàn)法研究PMMA/CS納米粒微球 在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)所列正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行九組實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析見(jiàn)表6。

表6　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析

圖1　PMMA/CS殼核納米微球的SEM照片

圖2　PMMA/CS納米粒紅外光譜圖

2.9PMMA/CS納米微球負(fù)載苦參堿及藥物釋放考察

2.9.1PMMA/CS納米微球負(fù)載苦參堿 取20mg苦參堿置于20mL棕色容量瓶中，用PBS=7.4的緩沖溶液定容。取1mL的苦參堿溶液，將與4mL的納米微球溶液（0.5g/mL）在25℃下快速混合2h，然后將混合液置入透析袋（10000～14000）中，用50mL二次蒸餾水透析2h。通過(guò)紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為208nm處檢測(cè)透析液中游離藥物的吸光值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照并計(jì)算出質(zhì)量，即未被負(fù)載苦參堿的質(zhì)量，計(jì)算出負(fù)載率為57.4%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將濃度分別為0、5、10、15、20、25μg/mL的苦參堿溶液置于波長(zhǎng)為208nm的紫外分光光度計(jì)中測(cè)吸光度，計(jì)算其線性關(guān)系為Y=0.0364X+0.0077，r=0.9994.

負(fù)載率=（M0-M1）/M0×100%（M0是苦參堿的總質(zhì)量，M1是未被負(fù)載苦參堿質(zhì)量）

2.9.2PMMA/CS納米微球負(fù)載苦參堿的藥物釋放測(cè)試 采用透析法考察負(fù)載苦參堿的納米粒在PBS=7.4中的釋放度。將洗去未被負(fù)載苦參堿的載藥納米粒置于透析袋（10000～14000）中，在25℃50mL的PBS=7.4溶液中釋放介質(zhì)。并在不同的時(shí)間取樣測(cè)吸光度，計(jì)算釋放率，見(jiàn)圖3。可以看出苦參堿溶液在45min的時(shí)候釋放率達(dá)到90%而被納米粒負(fù)載的苦參堿在16h才接近90%，表明PMMA/CS對(duì)苦參堿的負(fù)載可延緩藥物釋放。

圖3　負(fù)載苦參堿的PMMA/CS納米粒與苦參堿溶液體外釋放曲線

3　討論

APS和CS上的氨基構(gòu)成氧化還原體系，引發(fā)MMA在CS上的接枝共聚反應(yīng)，紅外圖（見(jiàn)圖2）可看出，1725cm-1，1149cm-1有明顯吸收，表明MMA已接枝上去。由于PMMA的憎水性和CS的親水性使其在水溶液中形成了微球型。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)其形成微球型進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明溫度、APS含量、MMA與CS質(zhì)量配比對(duì)殼核納米粒的粒徑有一定的影響。并進(jìn)行正交試驗(yàn)和對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行極差分析發(fā)現(xiàn)對(duì)接枝率和接枝效率影響為：配比＞APS含量＞溫度；且表明5號(hào)接枝率和接枝效率都是最高的，粒徑為217.5nm，PDI值為0.02，Zeta電位為34.4±7.11；SEM照片可看出合成的納米微球形貌皆為有殼核的球，粒徑大小都較為均一，分散性較好。因此在溫度為70°，APS含量為0.018g，MMA/CS配比為10時(shí)，可獲得性能較好，接枝率為88.1%，接枝效率為74.2%的納米粒，并將其用于負(fù)載苦參堿和藥物釋放度測(cè)試，結(jié)果良好。綜上所述，本研究確定了可形成穩(wěn)定，大小均一，黏連度低的合成PMMA/CS微球的條件，且該方法簡(jiǎn)便，成本低。并且使用水溶性的無(wú)機(jī)物引發(fā)劑比使用有機(jī)油性引發(fā)劑更容易除去，減小殘留物，更有利于此PMMA/CS納米微球作為酶固定化的載體或藥物載體。

［1］王芳寧,孫賓賓,周怡婷,等, 過(guò)硫酸銨引發(fā)丙烯酸甲酯接枝羧甲基甲殼素共聚[J].化學(xué)與生物工程, 2007, 24(6):18-20.

［2］Montri Ratanajanchai, Sunhapas Soodvilai,Nuttaporn Pimpha et al.Polyethylenimine-immobilized core-shell nanoparticles: synthesis,characterization, and biocompatibility test [J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2014, 34(1):377-83.

［3］Inphonlek S, Pimpha N, Sunintaboon P. Synthesis of poly(methyl methacrylate) core/chitosan-mixed-polyethyleneimine shell nanoparticles and their antibacterial property [J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2010, 77(2):219-226.

［4］Lee K D, Jeong Y I, Kim D H, et al. Cisplatin-incorporated nanoparticles of poly(acrylic acid-co-methyl methacrylate) copolymer [J]. Int J Nanomedicine, 2013(8):2 835-2 845.