CRISPR-Cas9技術在遺傳性疾病基因治療中的研究進展

梅雯，孫美濤，王唯斯，柴蓓蓓，張若鵬，王仁鳳，熊偉

1.大理大學 a.基礎醫學院，b.第一附屬醫院，云南 大理 671000；

2.昆明市祿勸縣湯郎衛生院，云南 昆明 651500

遺傳性疾病嚴重威脅人類健康，一直是人類面臨的難治性疾病之一，也是現代醫學重要的研究領域。隨著分子生物學理論與技術的發展，人們發現很多人類遺傳性疾病與基因突變有關。目前，基因編輯技術如傳統的鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFNs）、轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）及最新的 CRISPR-Cas9［clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR associated endonuclease 9（Cas9）］技術在遺傳性疾病基因治療方面發揮了重要作用。CRISPR-Cas9技術作為一種新型基因編輯技術，其操作便利性和適用性引起了普遍關注。探究CRISPR-Cas9技術的作用機制是一個長期探索過程，已有研究表明CRISPR-Cas9是細菌用以保護自身對抗病毒或噬菌體的一種防護機制，也是一種對付病毒或噬菌體的基因武器。與其他基因編輯技術相比，CRISPR-Cas9設計更為簡單，應用領域更為寬廣[1-2]。迄今，科學家們利用CRISPR-Cas9技術可對目標序列進行精確的定位操作，在生物醫藥領域有著廣泛的應用前景，為遺傳性疾病、癌癥及病毒感染性疾病等提供了新的治療手段。我們整理了近年來的相關文獻，將CRISPR-Cas9作用原理及其在遺傳性疾病基因治療中的應用、存在問題和展望做簡要綜述。

1 CRISPR-Cas9分子機制及作用原理

目前，根據Cas位點基因組織源性的不同將CRISPR-Cas系統分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ、Ⅲ型CRISPR-Cas系統降解外源DNA時需多種Cas蛋白參與，形成結構復雜的切割復合體。Ⅱ型系統由CRISPR、向導RNA（gRNA）和Cas9組成，缺一不可。其中gRNA決定Cas9核酸酶特異性切割位點，由其5′端約20 bp堿基進行特異性識別，Cas9蛋白具有調節crRNA（CRISPR RNA）結構及剪切雙鏈DNA的雙重作用，其作用是特異性切割外源DNA位點。目前對CRISPR-Cas9系統的研究頗多，在多領域基因組編輯中發揮重要作用[3-4]。CRISPR-Cas9系統結構比較固定，由5′端的反式激活 crRNA（tracrRNA），中間的 Cas9、Cas1、Cas2等蛋白編碼基因及3′端的CRISPR-Cas9位點共同組成，CRISPR序列包括間隔序列與重復序列。CRISPR-Cas9識別位點為PAM（protospacer adjacent motif），由 1～4個堿基組成[5]，一般為5′-NGG-3′結構，這類結構在幾乎所有物種基因組中存在，因此CRISPR-Cas9的識別位點幾乎包含所有生物，使得其在各學科中的應用受到廣泛關注和諸多研究[6]。當細菌被噬菌體或病毒等外源基因侵襲時，CRISPR-Cas9將識別入侵者的PAM并找到其原間隔序列，然后把入侵者身份信息作為間隔序列記錄到CRISPR序列中，當噬菌體或病毒再次入侵宿主，細菌在其前導區控制下，細菌轉錄重復-間隔序列轉錄形成pre-crRNA，pre-crRNA中的重復序列與同時被轉錄的tra-crRNA互補配對形成雙鏈小向導RNA（sgRNA），在Cas9蛋白的協同下被RNaseⅢ加工處理，形成成熟的crRNA，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復合物，識別并結合在與crRNA互補的序列上，隨后DNA雙鏈解開，形成R-loop環，之后crRNA與互補鏈雜交；另一條鏈保持單鏈游離形式，然后HNH活性位點剪切與crRNA互補的DNA鏈，RuvC活性位點剪切游離單鏈，Cas9蛋白引入雙鏈斷裂（DSB），隨后啟動2種DNA修復系統完成修復：非同源末端連接（native nonhomologous end joinijg，NHEJ）和同源重組介導的修復（homology-directed repair，HDR）[7-9]。NHEJ途徑對內源基因組DNA進行敲出或替換，此途徑不能進行精確控制。HDR通過引入外源DNA實現基因的精準控制。

2 CRISPR-Cas9在遺傳疾病治療方面的研究進展

2.1 CRISPR-Cas9技術對地中海貧血的基因治療

地中海貧血是一類遺傳性溶血性貧血疾病，對人類健康危害極高，也是全球最常見和發生率最高的一類單基因遺傳病。地中海貧血根據基因型不同分為4種，其中α和β型較為常見。但在基因治療方面，對β型地中海貧血（β-thalassemia，β-Thal）的研究較多。目前主要的技術思路是對β地中海貧血患者誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）通過CRISPR-Cas9技術校正血紅蛋白β（hemoglobin beta，HBB）基因，從而能夠分化正常紅細胞，達到治愈的目的。Ou等研究[10]證實，通過CRISPR-Cas9校正β地中海貧血患者的iPSC可以避免同種異體移植排斥反應，將CRISPR-Cas9校正后的iPSC注射免疫缺陷小鼠，隨后在該鼠中可看到HBB的表達，并且沒有發現有惡性腫瘤。后續研究發現與已接觸抗原的iPSC相比，處于分化早期的iPSC有更好的分化能力和修復能力[11-12]。Niu等[13]發現CRISPR-Cas9與單鏈寡脫氧核苷酸組合能夠校正β地中海貧血患者iPSC中的HBB基因CD41/42突變。Luo等[14]推薦內含子序列I2-1作為HBB的校正CRISPR靶點，可提高CRISPR對iPSC校正的安全性。但如果CRISPR-Cas9識別非目標DNA序列，可導致大量非靶標斷裂片段，致總染色體缺失[15]。Song[16]等報道了通過CRISPR-Cas9技術治療β地中海貧血，首先將患者來源的皮膚細胞誘導分化為誘導性多能干細胞（β-Thal-iPSCs），再用CRISPR-Cas9技術修復血紅蛋白β珠蛋白基因。結果顯示，基因修正后的細胞核型正常，在向造血細胞分化的過程中，可以高比例的生成各類造血祖細胞，并表達正常的β珠蛋白。2014年，Xie[17]等也運用CRISPR/Cas9技術結合piggy Bac轉座子有效地糾正患者來源的iPSCs，修復HBB基因，而且沒有出現脫靶效應，細胞呈現出完整的功能性和正常的細胞核型。Ye[18]等使用CRISPR/Cas9技術在造血干細胞和祖細胞中刪除13 kb的β珠蛋白基因，從而模仿自然情況下發生的遺傳性胎兒血紅蛋白持續存在綜合征（HPFH），結果發現刪除β珠蛋白位點的一部分回導致紅細胞的γ珠蛋白基因表達升高，這種模擬HPFH的方法可能為β地中海貧血和鐮狀細胞病病人帶來新的治療前景。CRISPR/Cas9技術為地中海貧血治療帶來了希望，但是仍然面臨許多困難，如經基因糾正后的HBB的分化能力、生存力和脫靶效應等安全性問題。

2.2 CRISPR-Cas9技術對杜氏肌營養不良的基因治療

杜氏肌營養不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種X染色體隱性遺傳疾病，臨床表現主要是因骨骼肌不斷退化出現肌肉無力或萎縮，目前尚無有效療法。該病通常由抗肌萎縮蛋白（dystrophin）基因突變引起，該基因位于染色體Xp21.2-p21.1，全長約2220 kb，包含89個外顯子，cDNA全長14 kb，是目前已知最大的人類基因。DMD的突變多為1個或幾個外顯子的缺失導致移碼突變或提前終止，不能合成正常的抗肌萎縮蛋白。目前，CRISPR-Cas9技術在杜氏肌營養不良的基因治療領域有著較大潛力。Mendell等[19]用腺相關病毒（adenoassociated virus，AAV）載體將特定的gRNA/Cas9轉入肌營養不良癥模型鼠（mdx）骨骼肌和心肌中，借此敲除mdx小鼠產生自發突變的23號外顯子，結果可翻譯成具有部分功能的抗肌萎縮蛋白。Li[20]等用CRISPR-Cas9技術通過3種校正方法（外顯子跳躍、移碼和外顯子敲入）校正DMD病人來源的iPS細胞，發現外顯子敲入最有效，進一步通過研究基因組的完整性、核型分析、拷貝數變異和外顯子測序來確定具有最小變異的克隆，最后成功檢測到抗肌萎縮蛋白的表達。Long[21]等建立杜氏肌營養不良小鼠模型，用腺病毒相關病毒AAV9在mdx小鼠模型特異性表達CRISPR-Cas9，觀察肌肉的結構和功能，糾正突變的抗肌萎縮蛋白基因。有研究[22]通過CRISPR-Cas9移除突變位點后，小鼠肌收縮力增加，組織學檢查發現肌肉組織中壞死現象出現逆轉、炎癥細胞浸潤減少、肌纖維化比例降低；此外，心肌細胞中的抗肌萎縮蛋白表達也有恢復。通過僅使用針對內含子區域的一個引導RNA（gRNA）來實現外顯子移除，野生型肌營養不良蛋白表達得到恢復，這種技術可以提高編輯效率并減少脫靶效應的風險，因而這項研究為攜帶致病基因的患者開辟了新的治療視角[23]。有研究表明，肌營養相關蛋白（utrophin）量的增加能夠彌補部分抗肌萎縮蛋白的損失[24]。CRISPR-Cas9可調控基因表達，sgRNA靶標肌營養相關蛋白基因的啟動子能使其編碼蛋白質的量增加1.7～6.9倍，通過提高肌營養相關蛋白的表達水平來治療該疾病。Ousterout[25]等同樣也用CRISPR-Cas9技術糾正DMD患者成肌細胞中的DMD基因突變，糾正后的肌細胞能表達正常的抗肌萎縮蛋白。目前我國仍有大量杜氏肌營養不良患者，雖然該病尚無非常有效的療法，但CRISPR-Cas9技術的迅速發展給DMD的治療帶來了曙光。

2.3 CRISPR-Cas9技術對α1抗胰蛋白酶缺乏癥的基因治療

α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）缺乏癥是一種先天性代謝遺傳疾病[26]。通過CRISPRCas9技術將α1-AT基因（AAT或SERPINA1，NC-000014.9）整合到人細胞系HEK293T的AAVS1位點，可以在細胞內表達重組α1-AT，因此，生成重組AAT蛋白是治療α1-AT缺乏癥極有希望的治療手段，可進一步用基因編輯手段改良肝臟干細胞，治療α1-AT 缺乏癥[27]。Smith 等[28]用 CRISPRCas9技術對含有Z-AAT點突變的α1-AT缺乏患者來源的iPSC進行遺傳修飾，發現能特異性靶向野生型和突變型等位基因，并能糾正基因突變位點，為α1-AT缺乏癥的治療開辟了新的思路。

2.4 CRISPR-Cas9技術對帕金森病的基因治療

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一種常見的神經系統退行性病變，其致病機理目前仍不清楚，但有研究表明遺傳因素在PD發病機制中發揮重要作用。

目前藥物和手術只可對癥支持治療PD，不能治愈疾病。有一種α突觸核蛋白與PD發病機制密切相關，這是在中樞神經系統突觸前及核周表達的可溶性蛋白質，有人提出能用CRISPR-Cas9對該蛋白進行實時監測，從而找出引發其水平異常的原因，對PD的治療十分重要[29]。CRISPRCas9技術作為治療遺傳疾病的一種新型手段，對PD的治療意義重大。迄今已發現至少6個易感基因與家族性PD有關，PARK16、PARK17和PARK18是PD的遺傳風險基因[30]，其中PARK17的病理機制研究較少。Ishizu等[31]為了研究PARK17在體內的作用機制，構建了Vps35 D620N敲入小鼠，表達具有內源性表達模式的同源突變蛋白。同時用CRISPR-Cas9技術移除小鼠PARK17基因外顯子15中的Vps35將顯著降低中腦黑質多巴胺的釋放，對緩解PD有一定的療效。此外，CRISPR-Cas9可通過逐個敲除相關發病基因尋找散發性PD的基因變異[32]。

2.5 CRISPR-Cas9技術對遺傳性酪氨酸血癥的基因治療

CRISPR-Cas9技術在遺傳性酪氨酸血癥基因治療領域也顯現出了它的優勢。有研究[33]通過CRISPR-Cas9敲除小鼠羥基苯基丙酮酸氧化酶（hydroxy phenyl pyruvate oxidase，Hppd）基因的3、4號外顯子，從而將Ⅰ型酪氨酸血癥肝細胞轉化為Ⅲ型良性酪氨酸血癥，與非編輯肝細胞Fah（-/-）/Hppd（+/+）相比，基因編輯后的肝細胞Fah（-/-）/Hppd（-/-）Ⅰ型酪氨酸含量明顯增長，而在部分小鼠中只出現Ⅰ型酪氨酸，在成功敲除小鼠Hppd基因的3、4號外顯子后的8周內，酪氨酸分解代謝變為正常，經治療后的小鼠健康，且無異常癥狀。2014年，Yin[34]等在活體成年動物體內糾正缺陷基因，治愈了遺傳性Ⅰ型酪氨酸血癥小鼠。他們以攜帶突變延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）的成年小鼠為模型，設計了3條單鏈引導RNA，靶向靠近突變位點的不同DNA序列，進一步將這些RNA引導鏈、編碼Cas9的基因，以及由199個核苷酸構成、包含正常FAH基因序列的DNA模板轉移至小鼠體內，采用高壓尾靜脈注射方式將上述CRISPR元件注入動物體內，最終進入肝細胞，1/250的肝細胞中存在正確的基因插入。轉基因細胞增殖，取代病變肝細胞，最終占據約1/3肝細胞，小鼠最終生存下來。

2.6 CRISPR-Cas9技術對Crygc基因突變白內障的基因治療

白內障是影響老年人視力及致盲的主要眼部疾病之一。2013年中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所李勁松團隊將Cas9 mRNA和sgRNA-4共同注射到攜帶Crygc基因突變的小鼠白內障遺傳疾病模型受精卵細胞質中，與對照組相比，經CRISPR-Cas9處理后的小鼠沒有出現白內障，最后發現有1/3的新生小鼠白內障得到治愈[35]。白內障小鼠突變的DNA得到修復后，正?；蛞搽S之遺傳給子代，子代的白內障得到根治。這是首次將CRISPR-Cas9技術用于Crygc基因突變所致白內障領域。此后，他們還成功地在精原干細胞中利用CRISPR-Cas9技術治療Crygc基因突變引起的白內障[36]。

2.7 CRISPR-Cas9技術對囊性纖維化的基因治療

囊性纖維化是囊性纖維化跨膜傳導調節因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突變導致的細胞膜對部分離子（如Na+）的通透性降低進而造成黏液分泌過多的一種疾病。過多的黏粘液不能自由流出呼吸管，因而一再造成感染，臨床表現為慢性阻塞性肺疾病，除此之外它也可能造成胰酶分泌不足，因而造成腹瀉。在囊性纖維化基因治療方面，Krishnan等[37]通過CRISPR-Cas9技術敲除CFTR基因的7號外顯子后，導致Cl-釋放減弱，并抑制氨基丁酸產生，降低神經興奮，此結果提示，敲除CFTR基因可調節突觸強度，且參與神經元功能的調節。Schwank等[38]用CRISPR技術以及一個包含插入修補序列的供體質粒糾正囊性纖維化患者的蛋白質錯誤折疊，修正后的基因表達正常，克隆類器官也獲得了適當的遺傳糾正，此項研究為單基因遺傳缺陷患者的原代成體干細胞同源重組基因校正提供了證據。

2.8 CRISPR-Cas9技術對鐮狀細胞性貧血的基因治療

鐮狀細胞病是在全球范圍內影響人類健康和壽命的一種血紅蛋白遺傳性疾病。鐮狀細胞貧血患者D鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，形成異常的血紅蛋白S（HbS），取代了正常血紅蛋白（HbA）。Dever[15]等發現，矯正患者的體外造血干細胞基因能治療鐮狀細胞貧血。研究者獲取患者造血干細胞后，用CRISPR/Cas9基因編輯系統在HBB基因的造血干細胞中實現同源重組，矯正突變的基因，然后對鐮狀紅細胞貧血病人的造血干細胞設計一個濃縮模型，對其細胞進行濃縮，超過90%的患者實現了靶向整合，獲得矯正的造血干細胞，16周后被編輯的細胞均移植入小鼠骨髓，矯正的造血干細胞仍具有造血功能，而且具有正常的紅細胞壽命。Huang等[39]用CRISPR-Cas9系統對鐮狀細胞性貧血患者的iPSC進行基因編輯，將病人的皮膚細胞誘導成iPSC，采用同源重組來修復發生突變的HBB基因，再將修復的iPSC定向誘導分化為造血干細胞移植到病人體內，基因修正后的iPSC可以成功地分化至網織紅細胞階段，并表達正常的β珠蛋白。

2.9 CRISPR-Cas9技術對血友病的基因治療

血友病為一組X染色體連鎖遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，表現為血漿中凝血因子合成減少或功能缺陷，凝血時間延長，輕者很輕微創傷就出血不止，重者即使不受傷也有“自發性”出血傾向。血友病分為A、B、C 3種，治療方法有替代治療和基因治療[40]。血友病A（hemophilia A，HA）又稱血友病甲，是由于凝血因子Ⅷ（F8）缺乏或功能缺陷引起的一種隱性遺傳性出血性疾病，一般女性為攜帶者但不發病，男性發病，患者可出現反復的關節出血，重者腦出血，目前尚無根治方法，近年來的基因治療給HA突變基因的修復帶來了曙光。Park等[41]用HA患者的體細胞誘導產生iPSCs，然后用CRISPR-Cas9基因編輯技術對iPSCs來源的F8進行校正，校正后的iPSCs可產生表達F8基因的內皮細胞，然后把校正后的成熟內皮細胞移植到F8缺失的血友病小鼠體內，移植內皮細胞的小鼠能正常產生F8凝血因子，出血癥狀得到控制，HA總體上得到控制和緩解。血友病B（hemophilia B，HB）是由于凝血因子Ⅸ（F9）缺乏或血漿凝血活酶成分缺乏而引起的一種遺傳病。血友病模型是基因治療的理想模型，很多研究者采用導入外源基因的方法治療基因疾病。Huai等[42]利用CRISPR-Cas9介導的原位基因組編輯技術構建HB小鼠模型，從小鼠尾靜脈注入Cas9/sgRNA，檢測到62.5%的HB小鼠中F9突變基因得到糾正，這對凝血功能不全具有有效的緩解作用。Cas9以蛋白質形式、sgRNA以RNA的3種不同形式發揮作用，將這3種形式的Cas9顯微注入血友病小鼠生殖細胞，研究基因校正的效率和安全性，可知Cas9蛋白具有較高的基因恢復率、胚胎毒性小，更適合生殖細胞基因治療。Guan等[43]在HB家族的F9基因中發現了一個新的突變位點y371d，用Cas9技術模擬y371d突變的HB小鼠模型，通過尾靜脈把Cas9/sgRNA注入y371d突變的HB小鼠，超過0.56%的突變F9基因得到糾正，極大地提高了止血效率和小鼠的存活率；與此相反，腺病毒載體系統具有更高的糾正效率，但由于它有嚴重的肝毒性而沒有治療效果。上述研究表明，CRISPR-Cas9介導的原位基因組編輯可為人類遺傳性疾病提供可行的治療策略，但其臨床有效性還須進一步研究。

3 結語

CRISPR-Cas9技術在基因遺傳病治療領域有潛在優勢，科學界為CRISPR-Cas9基因治療從概念變為現實付出了極大的努力，但目前該技術發展還存在瓶頸，在臨床應用上受到一定的限制。因為CRISPR-Cas9技術實現其特異性是由PAM前后20 bp不完全匹配序列的位點決定的，因此在理論上存在產生脫靶效應（off-target effects）的可能，實際應用也印證了其脫靶概率不低的事實。另外，CRISPR-Cas9技術在不同物種間的穩定性和重復性存在較大差異。因此，有必要對CRISPR-Cas9技術進行深入研究和優化，進一步提高其臨床應用的普遍性。但CRISPR-Cas9有其顯著的優勢，比如構建和設計方法簡單快捷、對基因組的點突變編輯效率高、可同時編輯多個基因。CRISPR-Cas9以其獨特的優勢為遺傳病、傳染病、癌癥等疾病提供強有力的研究和治療手段。遺傳性疾病一直是威脅人類健康的難治性疾病，從遺傳疾病相關突變基因的發現，到小鼠模型的構建，再到CRISPR-Cas9治療遺傳性疾病，CRISPR-Cas9在人類遺傳病基礎理論研究、臨床治療等領域具有光明前景。